Biologia dello sviluppo appunti

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Biologia dello sviluppo 10-01-07

Apoptosi

Le cellule in generale sanno fare tre cose: dividersi, differenziare e morire.
Nel corso dell’ontogenesi alcune cellule devono essere rimosse, o perché non servono o perché sono danneggiate o perché, si formano organi che sono ricordi evolutivi (e che quindi alla fine non servono) o per “scolpire” certi organi come gli arti.
Certi organi, a partire da un blocco informe, vengono rimodellati eliminando delle cellule. Prima si forma un abbozzo di organo, e da questo, l’organo vero e proprio. La morte cellulare rientra in questi eventi. La morte cellulare si osserva fin dai primi stadi dello sviluppo (quando abbiamo fino a poche cellule, come 10). Se noi blocchiamo la morte cellulare, lo sviluppo embrionale è impedito. La morte cellulare è un processo importante per lo sviluppo embrionale. Nell’adulto la morte cellulare serve, e se viene deregolata, sfocia in patologie.
Il concetto di morte cellulare inizia dall’800, quando con i primi microscopi si osservavano le cellule che si dividevano oppure che morivano. Il concetto di morte cellulare era già accettato ai tempi anche se non esistevano teorie in merito. Mentre gli studi sulla proliferazione cellulare erano abbastanza attivi dopo la seconda guerra mondiale, gli studi sulla morte cellulare sono rimasti fermi fino agli anni 80. Ciò è anche dovuto al fatto che è più difficile studiare la morte cellulare rispetto alla proliferazione. Quest’ultima è pù facile da osservare nei tessuti rispetto alla morte cellulare che è un evento molto raro (nel fegato 1 cellula su 10k muore). Siccome la proliferazione era stata connessa al cancro, quest’ultima si è sviluppata prima. Negli anni 70 è venuta fuori la storia degli oncogeni che sregolano il ciclo cellulare. La morte cellulare si pensava fosse un evento poco importante, gli fu dato poco peso. Esso ha invece una funzione molto importante ed è regolata geneticamente. Nel dopoguerrra, seppur lentamente, si svilupparono gli studi sulla morte cellulare. Se uno chiedeva un progetto di ricerca per essere finanziato sulla morte cellulare nessuno lo finanziava. L’interesse rinasce dall’ebriologia perché solo gli embriologi vedevano che tale processo era importante nello sviluppo dell’embrione. Questi sapevano che la morte cellulare era programmata e ben definita temporalmente come si può osservare nello svilluppo embrionale. Ma fino agli anni 60’ non c’erano dati specifici a riguardo. Alcuni esperimenti successivi mostrano che tale fenomeno poteva essere modificato, o bloccandolo o potenziandolo. Questo concetto di morte cellulare programmata buttò della basi. Un passo decisivo fu uno studio di un patologo australiano che era un microscopisca elettronico molto capace. Egli si rese conto che lui incontrava nelle cellule più diverse delle morfologie che erano le stesse quando andavano incontro a morte. Le cellule assumevano delle morfologie assolutamente riproducibili anche per cause diverse di morte.
Egli si rese conto che la morfologia era la stessa anche per cellule embrionali diverse. Questo fece pensare che vi era un vero programma genitico che guidava ciò. Qualunque cellula moriva veniva riconosciuta e fagocitata da cellule vicine. Fagociti professionisti come macrofagi e dendriti aveva il ruolo di fagocitare tali cellule ma, in certe condizioni, anche cellule “normali” come epatociti potevano farlo come una sorta di “cannibalismo”. Questo scienziato, grazie alla stessa morfologia delle cellule, pensò ad una regolazione comune biochimica. Egli, insieme ad un altro scienziato patologo, scrisse un testo a riguardo sulla morfologia delle cellule che morivano. Essi scoprirono che l’evento di morte di solito non è un evento massivo ma che invece coinvolge solo singole cellule. Quando tali cellule muoiono, se tale evento è ben regolato, il tessuto circostante non è assolutamente in grado di percepirlo. Non abbiamo infiammazione ed il sistema immunitario non si accorge minimamente di tale evento. Ciò è importante perché ogni giorno noi perdiamo circa un etto di cellule. Se queste cellule determinassero un evento infiammatorio non potremmo vivere. L’evento che caratterizza la morte cellulare fisiologica è la selettività e la non dannosità dell’evento per i tessuti vicini. Gli scienziati di prima, parlando con un proff di Greco, presero il nome di apoptosi che indica le foglie che cadono da un albero in autunno. La parola deriva infatti dal greco. Le cellule comunque muoiono in più modi non solo per apoptosi. Questo è solo un metodo. Se noi blocchiamo l’apoptosi, le cellule muoiono lo stesso ma solo dopo un pò di tempo. Questo indica che si attiva un altro evento di morte cellulare. Ciò indica l’importanza evolutiva di tale evento. L’apoptosi è solo un aspetto di morte celluare. Un inglese, Brenner (premio nobel per la medicina nel 2002), cercava dei modelli biologici per studiare il destino dello sviluppo delle cellule. Il C. Elegans poteva diventare un modello biologico interessante. Egli scoprì che tale vermetto nella sua vita fa sempre lo stesso numero di cellule. Tale vermetto, che può esssere maschio o ermafrodita, produce solo 1090 cellule. Le cellule sono sempre le stesse e svolgono sempre la loro funzione. Lui descrisse la genialogia di tutte le 1090 cellule. Cellula per cellula cosa facevano e come si differenziavano. Di queste cellule 131 invariabilmente morivano sempre (di queste il 50% sono del sistema nervoso). Se due cellule sorelle si erano generate da un precorsore precedente, avremo una cellula anteriore ed una posteriore. Se una di queste due cellule muore per motivi fisiologici non succede mai che muore l’altra al posto della prima. Geneticamente, ad esempio, muore sempre quella anteriore rispetto a quella posteriore. Questo era quindi un programma genetico ben definito data la sua specificità anche nella localizzazione della morte. Il C. Elegans completa il suo ciclo vitale in due settimane ovvero nasce e muore in due settimane. Essi fecero dei mutanti a caso su questi vermetti e isolarono mutanti per le cellule che morivano. Trovarono mutanti ad esempio ai quali morivano meno di 131 cellule. Questo dette la comprensione che la biologia della morte cellulare era basata sulla genetica e quindi aveva una validità. Tutto ciò coinvinse la comunità scientifica a studiare la morte cellulare. Per prima cosa bisognava avere dei modelli cellulari facili per studiare tale evento (ricorda che una sola cellula su 10k ad esempio muore) ed in tal proposito negli anni 80 furono proposti sistemi cellulari in cui morivano molte cellule. Durante lo sviluppo embrionale, nel timo, muoiono il 90% di cellule. Lì abbiamo una selezione clonale importante. Dai precursori che arrivano dal midollo al timo per fare linfociti, molti ne muoiono per selezione. Si ha quindi una morte cospicua di cellule. Preso il timo ed aperto, uscivano dei timociti che dopo 24 ore morivano tutti. Questo fu sfruttato come modello biologico per studi biochimici. L’ultima spinta fu data anche dall’importanza nella patologia. Si vide che, nel caso dell’HIV, le cellule dendritiche morivano per apoptosi. Nel 93’ Borghiz, che studiava il C. Elegans, clonò dei geni di C. Elegans per il programma di morte. Partendo dai geni di C. Elegans trovò degli ortotologhi nei mammiferi. Ormai le vie biochimiche e genetiche erano conosciute. L’apoptosi comunque è solo uno degli eventi di morte perché ne esistono altri.
Una cellula in apoptosi ha una superficie molto semplice e poco articolata. La cromatina è molto condensata a ridosso della membrana nucleare a formare delle regione dense. Quelle che si possono vedere nell’immagine del proff sono cellule T infettate dall’HIV. Queste caratteristiche sono comuni a tutte le cellule che muoiono per apoptosi. Le cellule si riducono di volume per quasi due terzi del loro volume originale in quanto perdono acqua. La cellule non esplode ma si condensa e impacchetta. Questo evita l’attivazione del sistema immunitario dato che non viene rilasciato nulla all’esterno che possa essere riconosciuto come “non self”. A volte però tali cellule si frammentano, soprattutto quando muoiono cellule con grande citoplasma. Questi frammenti si chiamano corpi apoptotici. Essi non rilasciano nulla all’esterno. La fagocitosi così è facilitata per le cellule vicine.
Si ha differenza tra morte cellulare e necrosi. La necrosi è una morte cellulare non fisiologicamente regolata indotta da qualche cosa di esterno. In questo caso non abbiamo meccanismi cellulari regolati. La morfologia di una cellula che muore per necrosi è ben diversa dalla morfologia di una cellula che muore per apoptosi. Una cellula che muore per necrosi induce risposta infiammatoria perché scoppia e rilascia il suo contenuto. In genere muoiono ampie parti di tessuto perché ci sarà un grosso evento chimico o fisico che danneggia il tessuto. Nella morte cellulare fisiologica invece di solito muoiono singole cellule. Nella necrosi la cromatina si marginalizza sulla membrana del nucleo mentre nell’apoptosi si condensa.

Filmato di fibroblasto:
All’interno dei mitocondri viene contenuta una proteina che poi si diffonde a partire da essi verso il citoplasma. La cellula, poi, perde volume ed emette dei prolungamenti detti Blebs che in seguito possono formare i corpi apoptotici. La cromatina si condensa mentre qualcosa si dispone sulla superficie. Questi eventi sono validi per tutte le cellule che vanno in apoptosi.

Se prendiamo troppo sole, le nostre cellule epiteliali muoiono. Sorattutto quelle dello stato basale dell’epidermide (sun burn cells). Tutti gli embrioni formano molte più cellule nei tessuti rispetto a quelle che gli servono. L’embrione deve fare presto e produrre tante cellule. Dopo solo quelle meglio formate vengono selezionate mentre le altre muoiono. Nelle cellule germinali primordiali solo alcune arrivano a destinazione mentre le altre muoiono per apoptosi. Nel sistema nervoso abbbiamo nello sviluppo il doppio di neuroni. La metà quindi morirà per apoptosi. La situazione di base delle cellule è quella di morire. Solo quelle che funzionalmente saranno capaci non moriranno. Questo è un meccanismo di selezione. Tutto questo permette ad esempio di non fare i check point durante la mitosi perché tanto le cellule che si sono riprodotte male non saranno in grado di andare avanti e quindi verranno eliminate dall’organismo. La selezione funzionale è basata sulla capacità di risposta agli stimoli ambientali che solo le migliori cellule hanno.
Uno dei primi esperimenti importanti fu fatto da Sanders che studiò un embrione di pollo ed in particolare la morte cellulare di alcune cellule che stavano alla base degli arti. Egli espiantò un pezzo di tali cellule e, dopo averle messe in coltura esse morivano lo stesso. Egli fece in parallelo un trapianto di tali cellule nella pancia dell’embrione. In questo caso osservò che, poste là dove non c’erano segnali di morte, si integravano e sopravvivevano. Questo ci diceva che tale fenomeno è ben regolato e regolabile. Le cellule tumorali possono morire ed in tali cellule quindi si può rievocare la morte cellulare. Quando Wille mise i timociti in coltura e vide che morivano, egli estrasse il DNA da tali cellule e lo corse su gel di agarosio. Egli però correndo in parallelo il DNA di cellule sane e di cellule morenti osservò delle differenze notevolissime. Il DNA non resta nel pozzetto ma entra nel gel e forma dei complessi a pesi molecolari regolari. Il DNA viene quindi frammentato. Aveva delle bande regolari fino a 180 bp. La cromatina sta impacchettata negli istoni in nucleosomi. Le lunghezza del ripiegamento è di circa 180 bp. Questo indica che durante la morte cellulare la cromatina viene tagliata da una DNAsi a livello dei nucleosomi. Quindi si potevano osservare dei frammenti multipli di circa 180 bp. Questo è stato il primo marker che ci aiutava a capire se una data cellula era in morte cellulare.
Le cellule morte per apoptosi devono essere rimosse il prima possibile. La fagocitosi ad opera di macrofagi e fagociti avviene prima che la cellula sia morte definitivamente. Pertanto la vera e propria morte avviene all’interno di tali cellule specializzate nella fagocitosi. Un macrofago può fagocitare fino a 10 corpi apoptotici. Anche cellule che normalmente non fagocitano possono farlo in certe condizioni. Un esempio classico è quello del fegato. Il fegato tende a detossificare agenti tossici. Questa detossificazione avviene anche soprattutto attraverso fenomeni di accrescimento del fegato. Il numero degli epatociti aumenta ma poi, quando abbiamo smaltito gli agenti tossici, tali cellule muoiono rapidamente per apoptosi. Nel topo in 5 giorni il fegato raddopia di peso. Due giorni dopo, il fegato torno al peso normale. Tali cellule extra però non vengono solo smaltite dalle cellule fagocitanti ma anche dagli epatociti che sopravvivono. La fagocitosi quindi è un evento mediato non solo da fagociti specializzati. La cellula che muore deve esprimere dei segnali sulla sua superficie. “Eat me signal” sono i segnali di morte. Essi sono molecole come lipidi e zuccheri che vanno sulla superficie. La morte cellulare è connessa a molte cose come l’età; come varie malattie-> ad esempio durante l’infarto o nel colpo apoplettico abbiamo morte cellulare; come anche in alcune infezioni ad esempio di HIV. Le cellule tumorali invece spengono il programma di morte cellulare e quindi proliferano senza morire. Ad ogni modo è possibile riesumare il programma di morte cellulare per tali cellule “impazzite”.

Il processo di apoptosi ha 4 fasi:

1) Fase di iniziazione
2) Potenziale capacità di morire: essere pronti per morire ed avere tutto quello che è necessario per morire (tutte le nostre cellule si trovano a questa fase e sono ferme grazie a varie proteine che ne evitano il proseguimento nella morte)
3) Esecuzione: cambia la morfologia delle cellule che poi espone i segnali di fagocitosi
4) Rimozione: e quindi morte vera e propria, e fagocitosi

Tali fasi sono a carico di vari geni. Ces = cell deth specification; Ced = cell death. Hanno vari numeri in base a quando furono scoperti. Ced 9 è il freno a mano che non fa morire le cellule. Se in C. Elegans mutiamo tale gene muoiono ben 700 cellule nell’embione. Ced 9 controlla anche negativamente Ced 3 e 4 che sono i geni che uccidono la cellula facendole cambiare la struttura (quindi fase 3). La fagocitosi è regolata da molti più geni. Tali geni sono ortologhi con i mammiferi. Se trasferiamo un gene omologo di uomo nel C. Elelgans, la funzione che aveva viene svolta correttamente. La funzione rimane quindi la stessa anche in organismi diversi. Ciò indica come i geni, seppur in organismi diversi, siano correlati.

Biologia dello sviluppo 15-01-07

Gli studi sul C. Elegans hanno portato a scoprire la genetica della morte cellulare ed hanno fatto comprendere che questo fenomeno fosse importante, facendo parte dei meccanismi cellulari fondamentali. Il C. Elegans è un modello assolutamente unico per studiare le genie cellulari dello sviluppo. In questo organismo sappiamo esattamente la genealogia di tutte le cellule, ovvero quale cellule deriva da quale. Gli studi sul C. Elegans hanno permesso di studiare molti meccanismi molecolari che sono alla base di tante malattie. Horvits, un premio nobel, ha studiato la morte cellulare. Il C. Elegans offre molti vantaggi tra cui il possedere un numero di cellule definito, oltre al fatto che il suo genoma è stato uno dei primi ad essere sequenziato. Alla fine degli anni 90’ già si conosceva tutto il genoma di C. Elegans che poi funse da prototipo per lo studio sul genoma umano. Questo modello è ottimo anche per fare studi di interference. Basta dare ai vermetti come nutrimento il dsRNAi per bloccare un gene di interesse. Questa tecnica è particolarmente facile in questi organismi. Il C. Elegans, inoltre, completa in tre giorni il ciclo vitale. Fra i vermetti abbiamo gli ermafroditi ed i maschi. L’embriogenesi avviene nella madre. L’ermafrodita ha 1090 cellule. Dallo zigote si formano due cellule che si differenziano in A, che sta per anterior, e P che sta per posterior (vedi schema nelle slide). Se una data cellule deve morire durante il normale sviluppo, morirà solo una cellula ben precisa fra le 2, ad esempio la A e non invece l’altra, ovvero la P. Geneticamente quindi tutto è controllato molto dettagliatamente. Studiando i mutanti è possibile vedere quali cellule sono state colpite, per effettuare vari studi. Nell’utero si formano le cellule germinali, crescono e fanno auxocitosi. Poi passano nella spermateca, dove gli ovuli vengono fecondati. L’embrione si sviluppa all’interno della madre. Borghizt (? O è Horvits?) isolò dei mutanti per la morte cellulare. Esistono un gruppo di geni che possono specificare la morte cellulare. Essi danno delle proteine che, se attivate, fanno morire la cellula. Il commitment è la fase in cui la cellula sa che deve morire anche se al momento c’è una sorte di freno a mano che evita ciò. Mentre la cellula va poi effettivamente in morte cellulare, essa espone degli “eat me signal” per essere fagocitata in modo da evitare la risposta immunitaria.
Ced 9 serve a bloccare i geni della morte cellulare. Se Ced 9 si attiva, essa attiva Ced 3 e 4 che uccidono la cellula. Tutti gli altri geni successivi sono quelli coinvolti nella fagocitosi. Anche nel C. Elegans, in cui non c’è un sistema immunitario, si hanno dei geni per la fagocitosi. Nuc 1 è stato il primo gene scoperto. Esso è una endonucleasi, ovvero un’enzima che taglia gli acidi nucleici. Nuc 1 serve a tagliare la cromatina a livello dei nucleosomi. Nuc 1 si attiva alla fine del processo di apoptosi. Il taglio della cromatina avviene dentro i fagociti, ed è essenziale solo per la degradazione del corpo apoptotico e non, invece, per la morte cellulare. Serve solo a degradare la cromatina della cellula. L’esperimento fondamentale che ha inziato gli studi sull’apoptosi, è stato fatto negli anni 80’ quando in australia un ricercatore prese un gene umano sospetto di essere l’omologo di Ced 9 ponendolo in un C. Elegans transgenico con mutazione per Ced 9 (che quindi non era più funzionale). Un C. Elegans con una mutazione in Ced 9 non è vitale. Se questo gene di mammifero è davvero l’ortologo, determinerebbe una complementazione del gene. A seguito di questo esperimento si verificò che effettivamente, il gene dei mammiferi che era stato scoperto, era ortologo di Ced 9 e ne compensava quindi la funzione. Il gene umano quindi compensava la funzione del gene mancante Ced 9. Questo esperimento ci dice che la funzione di queste proteine è conservata, seppure nel corso di milioni di anni si sono acumulate delle differenze. Solo alcuni domini funzionalmente attivi sono rimasti conservati. Horvits fu il ricercatore che scoprì ciò.
La controparte di Ced 9 nei mammiferi, si chiama Bcl 2 (B cell linfoma 2). Questo gene era già stato clonato da un italiano e da un giapponese che cercavano degli oncogeni. Bcl 2 è coinvolto nella carcenogenesi perché questo gene nei linfomi B (che sono tumori) va incontro ad una traslocazione passando dal cromosoma 14 al cromosoma 18. Questo gene va sotto il controllo del promotore delle immunoglobuline e quindi risulta molto espresso. Se una cellula accumula una grossa quantità di Bcl 2, resiste maggiormente alla morte, perché non va in apoptosi. Questa cellula può diventare facilmente una cellula tumorale anche se non lo è, perché in realtà, è solo resistente alla morte potendo così accumulare più mutazioni del normale tollerabile. C’è uno stretto legame tra controllo della morte e tumori. Utilizzando la sequenza di Bcl 2 si è visto che si avevano una ventina di omologhi nei mammiferi. Nei mammiferi abbiamo un’intera famiglia di Bcl 2. Studiando questi elementi egli (chi? Horvits?) fece una scoperta importante. Questi elementi si chiamano B più qualcosa (esempio Bax, Bak…). Intorno agli anni 90’ queste proteine venivano trasfettate per vedere come funzionavano. Quelle che assomigliano a Bcl 2 inibiscono la morte. Una di queste proteine, detta Bax, fu però presa e messa dentro delle cellule producendo strani effetti. Le cellule venivano rese più sensibile alla morte. Facendo degli immunoprecipitati per isolare la proteina, si trovò che, associato a Bcl 2, si aveva una proteina chiamata Bax, che dava la morte delle cellule. Ciò vuol dire che nei mammiferi esistono degli elementi pro-survival e degli elementi pro-morte nella stessa categoria. La maggior parte degli elementi che stanno dentro la famiglia di Bcl 2 nei vertebrati sono pro-morte. Queste proteine pro-morte si chiamano Bh3 conteining protein, in quanto hanno un dominio ripetuto (il Bh3). Esse vengono attivate da vari meccanismi ed appena c’è uno stimolo di morte si legano a Bcl 2 e ne inibiscono la funzione così da portare la cellula alla morte. La categoria iniziale di Ced 9 si è quindi evoluta in due sottocategorie, quelle pro-morte e quella pro-sopravvivenza. Egl 1, nel C. Elegans, ha un dominio Bh3 che la fa interagire con Ced 9 controllandone la funzione. Queste proteine sono pertanto i regolatori dell’apoptosi, ma chi è allora il killer? Ced 3 e Ced 4 per quanto riguarda il C. Elegans. Horvits clonò Ced 3 e vide che la sua sequenza era omologa a quella di una proteina di mammifero importantissima nell’infiammazione e nel sistema immunitario. Questa proteina era una proteasi in grado di tagliare altre proteine. Si trovarano pertanto 14 caspasi nel genoma umano. La famiglia delle caspasi (Cistein aspartate proteasi), è composta da proteasi che hanno nel sito attivo una cisteina. Queste proteasi tagliano a livello di un residuo di acido aspartico ed in generale sempre in siti specifici. Anche questa famiglia nei mammiferi è ridondante con varie sottosezioni e sottofunzioni. Nei mammiferi abbiamo, ad esempio, la caspasi 3, 9, 4 e 7. La caspasi 1 è quella importante nell’infiammazione (di cui abbiamo detto prima), ed è chiamata ICE. Le caspasi svolgono anche altre funzioni nel differenziamento terminale come la caspasi 14 che è presente soltanto negli epiteli e serve per il differenziamento dei cheratinociti. Durante l’apoptosi vengono degradate fino a 400 proteine ad opera delle caspasi. Fra queste abbiamo proteine strutturali del cistoscheletro come actina, miosina ecc… oltre ad enzimi che controllano la traduzione e la trascrizione.
Un giapponese trovò una proteina nel genoma umano, la sequenziò e scoprì che era omologa al Ced 4 scoperto da Horvits. Tale proteina umana è Apaf 1. Si scoprì successivamente che Bcl 2 sta sia nei mitocondri che nel reticolo endoplasmatico. Il giapponese che aveva scoperto la Apaf 1, aveva scoperto anche che serviva il citocromo C per far funzionare la Bcl 2. Il citrocromo C, nella morte cellulare, fuoriesce nei mitocondri e va ad interagire direttamente con Ced 4, Ced 3 e Bcl 2 stimolando il sistema di morte cellulare. Il mitocondrio quindi è la base nell’induzione dell’apoptosi. Sappiamo che i mitocondri sono dei simbionti. In qualche strano modo si è avuta un’associazione che ha portato i mitocondri ad essere un organello adibito anche al controllo della morte cellulare. Il mitocondrio è quindi al centro di tutto.
Bcl 2 sta nei mitocondri ed anche sul reticolo endoplasmatico. Gli stimoli di morte possono essere intrinseci o estrinseci. Intrinseco è quando abbiamo un danno irreversibile del DNA che non può essere riparato. Se il danno è troppo esteso viene infatti sintetizzato p53 invece di p21 (che ripara i danni al DNA quando è possibile. Non sono sicuro di questa parte). P53 attiva quindi un gene, Bax che induce la morte cellulare. Bax è controllato da p53. Bax, attraverso il suo dominio BH3, si lega a Bcl 2 che sta sul mitocondrio. Bax, legandosi a Bcl 2, ne blocca la funziona. Senza Bcl 2 funzionante la cellula non sopravvive e va incontro a morte. Bax si lega anche ad altri membri come Bak. La quantità di Bax è determinante e, quando satura tutto il Bcl 2, forma degli omodimeri con se stesso. Quando Bax si lega con se stesso, cambia la sua struttura tridimensionale che porta alla formazione di buchi nella membrana mitocondriale. Questi buchi fanno fuoriuscire tutte le proteine che stanno nello spazio intermembrana del mitocondrio compreso il citocromo C. L’apparato di morte consta di Bcl 2, caspasi 3 e 9 e Apaf 1. Bcl 2, quando sta legato in posizione di sopravvivenza nel mitocondrio, è legato direttamente ad Apaf 1 che a sua volta è legato alla caspasi 9. Quando Bax si lega a Bcl 2, sostituisce il legame con l’Apaf 1. Il citocromo C, che esce per quanto detto prima, si lega ad Apaf 1, caspasi 9 più ATP. Quando questo complesso si forma, la caspasi 9 viene attivata cominciando il suo compito di taglio. La prima proteina ad essere tagliata è la caspasi 3 che, a sua volta, comincia a tagliare la tubulina, l’actina e le proteine coinvolte nella trascrizione e nella traduzione. Solo la caspasi 3 è quella che effettivamente taglia. A sua volta però la caspasi 3 attiva la caspasi 7, portando alla fine, alla distruzione della cellula. Questo è il pathway intrinseco mitocondriale. Viene detto apoptosoma la struttura che controlla l’apoptosi. Esso è formato da Apaf 1 e caspasi 9. (rivedere le componenti)
Le cellule possono morire anche per stimoli estrinseci, cioè stimoli che vengono da fuori. La via sarà quindi diversa. Questa via prevede dei recettori che stanno nella membrana, recettori detti di morte. Essi erano quasi tutti noti come l’Ncf. Il C. Elegans non ha regolazione estrinseca ma solo intrinseca. Negli anni 80’ alcuni immunologhi mettevano cellule tumorali in animali per studiare gli anticorpi prodotti. Alla fine degli anni 90’ fu scoperto un anticorpo che riconosceva le cellule tumorali. Se questo anticorpo veniva messo in un animale con un tumore, uccideva le cellule tumorali. Successivamente si è scoperto che l’antigene che viene riconosciuto da questo anticorpo è presente anche in altre cellule normali come gli epatociti. Cd95L (L sta per ligando) è il ligando che lega il recettore Cd95R (R sta per recettore). Quando tre molecole del recettore clasterizzano, esse legano un adattatore che riconosce il dominio di morte. L’adattatore FADD (death domain apoptosis factor) ha un secondo dominio che lega una proteina, una capsasi 8 o 10. Quando avviene il legame al recettore, i FADD dimerizzano e si attivano, attivando a loro volta la caspasi 3 che sta solubile nel citoplasma. Il complesso detto prima si chiama Disc. In questo modo viene svolta la stessa funzione del apoptosoma. Un ligando può quindi indurre morte nella cellula legandosi ad un recettore che attiva questa via.
La morte cellulare è un processo così importante che si sono sviluppate più vie complemementari di modo che se una non funziona, subentra l’altra. L’apoptosi non è l’unica via di morte ma ne esistono altre.
Nella famiglia delle Bcl 2 abbiamo diverse sottodivisioni in base ai domini che possiedono. La morte nella cellula può attivarsi da varie parti grazie alle proteine che hanno il dominio Bh3. Bim, ad esempio, è localizzato nel citoscheletro. Se la tubulina ha un danno, Bim attiva il meccanismo di apoptosi. Se in un distretto c’è un danno, esse si staccano e vanno ad attivare la morte. Il Bh3 interagisce con Bax. Se noi mettiamo una proteina con Bh3 domain all’interno di una cellula, ne induciamo la morte cellulare. Si stanno sperimentando quindi dei peptidi mimetici per uccidere cellule tumorali.
Il rilascio del citocromo C è un evento molto precoce nella morte cellulare. Il ligando Cd95L sta sulla superficie di molte cellule, in particolare linfociti T e B attivati che permettano ad altre cellule di uccidere altre cellule. Questo meccanismo viene quindi sfruttato dal nostro sistema immunitario. Occhio, placenta e gonadi sono siti di immuno privilegio perché sono insensibili all’attacco dei linfociti. Essi contengono il ligando per Fas (uguale a dire il ligando CD95L).

Biologia dello sviluppo 17-01-07

Una cellula dopo che va in apoptosi, se non viene fagocitata, assume acqua fino a riempirsi e scoppiare rilasciando i suoi contenuti ed attivando il sistema immunitario. Questa è detta necrosi secondaria.
Sul “death domain” si legano recettore ed adattatore. La caspasi inattiva ha un pro-domain che interagisce con Fadd. Quando esso viene tagliato, si attiva e comincia ad essere funzionale. Le caspasi 8 e 9 sono quelle che attivano le altre caspasi. Questo fenomeno si è evoluto tardivamente. Gli animali che non hanno un sistama immunitario, hanno solo la via intrinseca di morte cellulare. La via estrinseca è importante ad esempio per infezioni batteriche e virali. Le nostre cellule infettate da virus, vengono riconosciute ed eliminate. I linfociti Cd8 uccidono le cellule bersaglio danneggiate e/o infettate, tramite un sistema di recettori di superficie.
I linfociti si formano nel timo grazie ad un processo di selezione su cellule staminali indifferenziate che entrano nella corticale del timo e vengono selezionate. Tali cellule per andare avanti nella selezione devono avere un T Cell receptor. Queste cellule se esprimono il T Cell receptor possono riconoscere alcune molecole dell’MHC così che possano ricevere un segnale di sopravvivenza. Tutte le cellule precursore che non hanno un T Cell receptor funzionale, muoiono perchè non ricevono lo stimolo di sopravvivenza. Solo le cellule più capaci sopravvivono. La stessa cosa avviene nei neuroni. In generale un organismo in via di sviluppo produce molte più cellule ma poi una selezione lascia solo le migliori in vita. Su 100 linficiti, ad esempio, solo 10 sopravvivono passando nella corticale. Quì avviene una seconda selezione basata sul possesso di Cd4 e/o Cd8. Se tali linficiti sono ben formati e riconocono i loro ligandi specifici, possono andare in circolo. Questo è un processo di selezione chimica. Quano la cellula riceve uno stimolo di sopravvivenza, vuol dire che riceve una proteina della famiglia di Bcl 2 che ne blocca la morte programmata. Le via antimorte sono legate spesso a Bcl 2. Ad ogni modo se la cellula riceve uno stimolo forte di morte, si attiva lo stesso tutto il sistema di morte cellulare. Un segnale di sopravvivenza porta a esprimere più membri di Bcl 2 pro-survival. Un linfocita Cd8 attaccato ad una cellula bersaglio, ne induce la morte cellulare. Come fa il nostro sistema immunitario ad autocontrollarsi? Il nostro sistema immunitario si attiva e comincia a proliferare nei linfonodi. Da poche cellule di memoria si espandono molte cellule effettive. I CTL o linfociti citotossici, quando riconoscono la cellula target, legano l’MHC tramite il TCR per eliminare la cellula. La cellula espone il recettore di Cd95 per morire. Il lingando che si lega al recettore, attiva la morte cellulare. Un linfocita attivato, che ha riconosciuto il corretto antigene sotto stimolo di TCR e MHC, espone il ligando che riconosce sulla cellula bersaglio il recettore che ne induce la morte. In topi che mancano di Cd95, i linfociti sono comunque in grado di eliminare cellule bersaglio tramite un secondo meccanismo. Il secondo meccanismo, dopo l’interazione tra MHC e TCR, produce la perforina che crea dei pori sulla membrana plasmatica. Dentro questi pori il linfocita Cd8 inietta una proteina detta GrB che, quando viene introdotta dentro, va direttamente ad attivare le caspasi. Il Grb è, a sua volta, una caspasi che attiva la caspasi 9 o 8 (controlla), che a loro volta attivano la caspasi 3. L’evoluzione ha quindi prodotto due modi per eliminare una cellula bersaglio. I CTL, (linfociti C) prodotti dalle cellule della memoria, proliferano sotto stimolo di un’infezione, ma, nei giorni successivi alla rimozione dell’infezione, le cellule vengono eliminate. Si autoeliminano. Come? Nel meccanismo di produzione del ligando c’è un metodo per eliminare tali linfociti. I linfociti T attivati, che hanno il ligando di Cd95, hanno anche il recettore di Cd95, dato che sono le cellule uguali dello stesso clone di cellule T. Queste cellule quindi, dopo aver interagito con il loro bersaglio, interagiscono anche fra di loro uccidendosi. Per questo motivo i linfociti diminuiscono di numero dopo le infezioni. Le cellule che hanno più Bcl xL probabilmente diventeranno cellule della memoria e quindi non moriranno. Nel sistema immunitario quindi muoiono molte cellule ogni giorno per questo motivo.
Alcuni siti del nostro organismo sono molto delicati e quindi sono detti siti di immunoprivilegio. Questi siti che sono l’occhio, la placenta e le gonadi maschili, sono siti in cui c’è stato un differenziamento molto sofisticato. Queste cellule fanno una cosa unica che le altre non fanno. Esse costitutivamente esprimono il ligando di Cd95. Se per caso un linfocita T decide di eliminare qualche neurone della retina, ad esempio, non può farlo. Dato che il linfocita T porta il recettore di Fas (o CD95 che è la stessa cosa), trova su quelle cellule il ligando e viene eliminato dalle sue stesse cellule bersaglio. Un sito di immunoprivilegio è quindi un sito in cui le cellule esprimono costitutivamente il ligando che va a legarsi al recettore che sta sulle cellule T.
Le cellule che muoiono, vengono fagocitate durante la morte. Questo evento precede la vera morte della cellula che muore all’interno del fagocita. In C. Elegans molti mutanti trovati erano difettivi per la fagocitosi. Horbitz (o Horvits?) vide che era impossibile bloccare la fagocitosi solo bloccando un gene coinvolto nella fagocitosi. Sono necessarie più mutazioni per ottenere un effetto sul fenotipo. Il sistema è ridondante. Tutti questi geni servono perché c’è bisogno di un sistema di riconoscimento tra ligando e recettore. Alcuni geni stanno sul corpo apoptotico ed altri stanno sulla membrana esterna e vengono riconosciuti dai fagociti. Una cellula che muore deve esprimere le “eat me signal” per essere rimossa. Il fagocita riconosce più siti e la fagocita. Avremo un recettore sul fagocita ed un ligando sul corpo apoptotico. Quando la cellula va incontro a morte, una delle prime cose che fa, è porre all’esterno un fosfolipide, la fosfatidilserina. Questo fosfolipide è un costituente normale della membrana ed è rivolto all’interno. Quando la morte viene indotta, una flippasi fa passare questo fosfolipide sullo strato esterno della membrana. Le cellule vicine riconoscono questo recettore. Alcuni geni di C. Elegans producono componenti più o meno importanti dell’apparato citoscheletrico della cellula perché una cellula che fagocita deve rimodellare il suo citoscheletro. Una cellula che fagocita deve rimaneggiare le sue componenti del citoscheletro. Abbiamo quindi, anche elementi del cistoscheletro. Se noi facciamo esprimere alcuni geni su cellule cancerogene, possiamo selettivamente farle uccidere dai fagociti. Le cellule cancerose stesse, quando diventano aggressive, acquisiscono la capacità di fagocitare tutto quello che hanno accanto. Un tumore deve cibarsi e acquisisce la eterofagia, mangiandosi le cellule vicine. Se noi facciamo esprimere la fosfatidilserina nelle cellule del tumore, esse verrebbero mangiate dai nostri fagociti. Bisognerebbe trovare uno stimolatore della flippasi specifico per alcune cellule e non per tutte. La non rimozione corretta delle cellule apoptotiche scatena processi infiammatori a causa della necrosi. Questo alla fine determina autoimmunità.
Il legame tra morte cellulare e cancro è quindi subito evidente. Una cellula cencerogena ha segnali di crescita spenti, deve essere metastatica e deve sostenere un’angiogenesi adeguata oltre ad essere più resistente a stimoli di morte. Tali cellule non sono però completamente resistenti, ma solo più del normale, dato che alterano alcuni punti relativi al controllo della morte cellulare. Il primo legame tra morte e tumori è Bcl 2. Questo gene si era visto che in molte cellule cancerogene era traslocato da un cromosoma ad un altro. Esso non è oncogenico ma da maggiore probabilità di sviluppare tumori. Un tumore è tale quando è invasivo. P53 è una proteina che controlla il nostro genoma ed i danni ad esso. Se p53 è mutato, queste cellule mutanti possono accumulare danni al DNA senza essere eliminate. Il 50% dei tumori ha p53 mutato. Siccome nella famiglia di p53 abbiamo anche altri elementi simili, almeno il 70% dei tumori ha mutazioni in questa famiglia genica. L’accumulo di mutazione di p53 o l’iperespressione di Bcl 2, non sono veri e propri oncogeni ma contribuiscono a rendere le cellule molto resistenti alla morte. Queste cellule, essendo resistenti alla morte, sono anche più resistenti ai chemioterapici. Quello che possiamo fare è agire rispetto alle mutazioni di p53 ad esempio. Se in una cellula tumorale mettiamo un p53 wild type, la cellula muore subito. Una terapia genica potrebbe essere basata sul mettere p53 dentro una cellula. In questo caso, inoltre, anche se noi mettiamo p53 dentro una cellula normale, non si creano problemi. Anche se mettiamo p53 in tutte le cellule dell’organismo, moriranno solo quelle con grossi danni al genoma, e non quelle normali. L’altra via è quella di trovare delle molecole mimetiche come Bcl 2 da immettere nelle cellule. Si fa un peptide di nove AA identico al “Bcl 2 domain” che viene veicolato nelle cellule trovando Bcl 2 e bloccandone l’azione. Questo però può dare problemi se usato per tutte le cellule.
Esistono diverse proteine che possono bloccare l’apoptosi in certe condizioni. Le IAP, ad esempio, bloccano le caspasi 3 e sono molto concentrate nei tumori. Vari blocchi possono essere costituiti anche da virus oltre che da tumori. Alcuni virus addirittura hanno una proteina simile a Bcl 2 che evita la morte della cellula. Abbiamo quindi vie attraverso le quali si può prevenire la morte cellulare.

Biologia dello sviluppo 20-12-06

Proteine di adesione

Nell’embriogenesi abbiamo visto cellule che erano staccate e che si sono unite così come l’inverso. L’embriogenesi è basata su interazioni dirette o meno tra cellule.
Tratteremo come le cellule si uniscono o si attaccano tra loro. Se c’è un sistema biologico nel quale la plasticità è fondamentale, questo è l’embrione (esempio nella gastrulazione in cui abbiamo molti movimenti). Tutto questo è regolato da proteine di adesione. Esistono 2 classi di proteine di adesione tra cellule: Omotipiche (stesse cellule) o eterotipiche (esempio limite-> cellule diverse come l’uovo con lo spermatozoo). Il sangue e le cellule del sangue costantemente stabiliscono delle adesioni fra di loro o con altre cellule. Nella presentazione antigenica un macrofago ha digerito qualcosa che poi viene messo nel complesso maggiore di istocompatibilità e viene riconosciuto dal linfocita. Interazioni fra cellule non sono solo definitive come quelle ad esempio delle cellule epiteliali (giunzioni strette ecc…) ma le proteine di adesione svolgono una funzione enorme e varia all’interno dell’organismo.
Ad esempio nella saldatura del tubo neurale abbiamo unione di cellule che si uniscono e tanti altri esempi. Il distacco allo stesso tempo, come l’adesione, è fondamentale. Le cellule delle creste neurali si staccano e questo è un evento importante. La gastrulazione avviene quando i micromeri si scollano perdendo proteine di adesione. Alcune di queste cellule poi si riuniscono tra loro. Il differenziamento altera anche le proteine di adesione espresse. Sfruttando alcuni enzimi come quelli che tagliano lipidi, zuccheri e proteine è stato possibile utilizzarli per vedere cosa teneva unite le cellule tra loro (proteine, lipidi o zuccheri?). Essi presero un tessuto vivo e lo sottoposero a queste tre classi di enzimi: proteasi, lipasi e glicosidasi. Se prendiamo un tessuto è aggiungiamo una lipasi non riusciamo a scindere cellule sane ma solo morte. Con le glicosidasi il tessuto resta abbastanza integro. Se invece applichiamo delle proteasi come la tripsina dopo pochi minuti otteniamo da un tessuto delle cellule singole ma se le lasciamo in coltura, dopo un pò si riattaccano al tessuto. Così si scoprì che le cellule stanno insieme grazie a ponti di proteine.
Tramite le spugne (che hanno un solo tipo di cellule a monostrato più cellule riproduttive) si fecero degli esperimenti per vedere se le proteine di adesione di spugne diverse, una chiara ed una scura, trattate con tripsina, vengono mescolate. Si osservò che le cellule scure si riuniscono con le cellule scure mentre le cellule chiare si riuniscono a quelle chiare. I due tipi cellulari si riuniscono in maniera specie specifica per tutti i tipi cellulari. Le proteine di adesione quindi si riformano ma in maniera specie specifica. All’interno della specie specificità c’è anche una tessuto specificità cioè cellule dello stesso tessuto si riuniscono nella loro posizione. Le proteine di adesione sono quindi molto specifiche sia come specie cellulare che come tessuto.
Presa una blastula di anfibio, si prende un pezzo di piastra neurale e un pezzo di ectoderma. Essi vengono trattati con tripsina e si lasciano in coltura per un pò. Dopo si forma un aggragato di cellule e questo aggregato si riorganizza con ectoderma all’esterno e tubo neurale all’interno. Nell’embriogenesi, fin dai primi stadi di sviluppo, le proteine di adesione prodotte sono tessuto specifiche e anche con una certa specificità di posizionamento. Abbiamo priorità di organizzazione e quando si formano questi aggregati sferoidi la posizione segue sempre l’organizzazione dell’embrione: cellule ectodermiche all’esterno, cellule mesodermiche in mezzo e cellule endodermiche all’interno. Questo processo non è casuale ma ben regolato. Grazie alla scoperta della struttura delle membrane (mosaico fluido) e grazie allo sviluppo dell’immunologia per usare anticorpi, dei quali si sfrutta la loro grande specificità, si poterono fare dei passi avanti nello studio delle proteine di adesione. Tutto questo è avvenuto intorno agli anni 70’. Gli anticorpi possono essere policlonali e monoclonali. Gli anticorpi policlonali riconoscono più parti di un antigene (ad esempio una proteina). Gli anticorpi monoclonali riconoscono una sola porzione della proteina e sono specifici per quel tratto che riconoscono. Nel policlonale abbiamo tanti anticorpi che riconoscono la stessa proteina anche se non sappiamo quale sito specifico stiamo studiando. Nel monoclonale abbiamo una specificità del sito che viene riconosciuto e quindi ad esempio l’anticorpo blocca il legame con il ligando se quella regione era specifica per il legame con il ligando. Preso un embrione di pollo, dopo essere stato aperto, sono state prese cellule del tubo neurale che sono state messe in coltura. Da queste cellule sono state prese le componenti della membrana plamatica purificandoli. Messe tali componenti in un coniglio, sono stati generati molti anticorpi specifici. L’antisiero prodotto riconosceva un pò tutte le proteine della MP dell’embrione di pollo. Fra tutte queste proteine è stato necessario riconoscere solo quelle che erano di adesione grazie ad esperimenti di competizione. Per identificare quali anticorpi erano utili al loro fine hanno messo a punto questo sistema. Prese le cellule neurali in coltura, esse si attaccano e si legano tra loro formando un gruppetto di cellule. Se le cellule neurali separate si riuniscono vuol dire che dopo un pò si riformano. Mettendo le cellule neurali con gli anticorpi prodotti (siero di coniglio), gli anticorpi che si legano alle proteine di adesione bloccano l’adesione stessa per competizione. I ricercatori frazionarono gli anticorpi per selezionarli in modo da trovare un pool di anticorpi specifici per le proteine di adesione. Essi trovarono una frazione di anticorpi che inibivano l’adesione. Già allora esistevano delle tecnologie che permettevano di identificare le proteine riconosciute tramite Western Blot. Tramite questa tecnica si possono separare le proteine in base alla grandezza della proteina piuttosto che in base alla carica. Esse migreranno in base al loro peso molecolare se hanno la stessa carica. Quando mettiamo il nostro foglio di cellulosa con le frazioni di proteine ricavate dal western in mezzo all’anticorpo, questi ultimi legano le loro proteine specifiche antigeniche e, in base a dove è visualizzabile tale evento, possiamo sapere il peso molecolare della proteine.
Se i ricercatori correvano un estratto di cellule neurali adulte, avevano una banda, se invece prendevano le stesse cellule ma prese dall’embrione, avevano una banda diversa più grande.
N-Cam, neural cellular adesion molecule è una proteina di adesione che si scoprì aveva tre tipi diversi di espressione (a causa di splicing alternativo) che davano quindi bande diverse. Si ebbero quindi tre prodotti di splicing dello stesso gene. Durante l’embriogenesi N-Cam non viene maturato tramite splicing ma tutto il gene viene tradotto mentre nell’adulto vengono prodotte due forme diverse più piccole una da 180 e una da 140KD. N-Cam è una proteina intrinseca che viene modificata post-traduzionalmente con zuccheri di cui il terminale è l’acido sialico. Questi zuccheri rendono meno forti i legami tra le N-Cam. Gli zuccheri quindi interferiscono un pò con la migrazione del gel. Le forme dell’adulto sono più piccole e con molti meno zuccheri. Nell’embrione abbiamo una proteina più grande e con più zuccheri che rendono più debole il legame di adesione. Ciò è importante per tutte le funzioni che le cellule neurali embrionali devono svolgere, e quindi della plasticità di cui hanno bisogno. La N-Cam embrionale verrà solo dopo scambiata con le forme adulte che hanno legami più forti tra loro. N-Cam ha un peduncolo nella parte citoplasmatica, una regione transmembrana e degli occhielli fatti da ponti disolfuro. Se abbiamo due cellule che esprimono entrambe N-Cam, le Cam si appaiano come una zip affacciandosi sugli occhielli che le compongono. L’acido sialico da fastidio perché distorce un pò il ponte che si viene a formare tra le due N-Cam, questo facilita le varie funzioni delle cellule neurali embrionali.
Nel fegato abbiamo le L-Cam che non differiscono tra embrione ed adulto. Questo ha senso perché il fegato si forma in una parte terminale dello sviluppo. Ng-Cam è un’altra proteina di adesione che interagisce con la glia. Esso è simile, tranne piccole differenze, all’N-Cam. La regione del peduncolo citoplasmatico serve ad influenzare la cellula. Quando la Cam è attaccata ad un'altra Cam essa ha un peduncolo diverso che permette alle cellule di sapere di stare in uno stato di pluricellularità o no. Quando due cellule hanno proteine di adesione “attive” (cioè sono legate ad altre cellule) non entraranno mai in mitosi. Se gli diamo tanti fattori di crescita esse muoiono perché l’essere impegnate in un legame significa non poter fare mitosi. La regione del peduncolo si lega al citoscheletro e spesso sono presenti G protein e/o chinasi che mediano i segnali all’interno della cellula. L’adesione ha quindi anche un gran valore funzionale oltre che di adesione. Si scoprì che l’anticorpo è una sorta di specializzata Cam perché la sua struttura è molto simile (stessa struttura ad occhielli), la famiglia è infatti la stessa. Quando gli anticorpi si legano stabiliscono un legame. Avremo quindi la famiglia delle immunoglobuline. Abbiamo tre grandi famiglie di proteine di adesione. Una è quella delle immunoglobuline. Esempio, N-Cam, CD4 e CD8 sono Cam del tipo immmunoglobuline. I virus sfruttano recettori di superficie o proteine di adesione. Oltre alle immunoglobuline abbiamo anche le caderine (calcio aderine), proteine che hanno bisogno di calcio per fare legami. La L-Cam è ad esempio una caderina. L’ultima famiglia è quella Saccharide mediated Cams, come la bindina (fecondazione), cioè proteine di adesione che necessitano di saccaridi.
Nell’embrione delle cellule durante lo sviluppo devono potersi scollare. Finchè ad esempio le cellule del mesoderma stanno nella blastula rimangono legate, ma quando perdono le loro proteine di adesione potranno scollarsi ed entrare all’interno fino a quando non potranno rilegarsi ad altre cellule tramite specifiche proteine di adesione. Nel tubo neurale, quando esso si chiude, le cellule all’esterno sono quelle che diventano cellule neurali ma nello specifico cellule delle creste neurali che poi si spostano per svolgere diverse funzioni. Quelle invece all’interno del tubo neurale si legano fra loro perché hanno tutte le N-Cam di cui abbiamo già detto.

Biologia dello sviluppo 08-01-07

Tale adesione è data da speciali proteine dette Cam che vengono classificate in tre sottogruppi. Esse sono importanti perché fanno interagire le cellule fra di loro. Anche le giunzioni permettono l’adesione tra cellule. Tali proteine di adesione sono qualcosa di dinamico e non statico. Queste possono essere giunzioni stabili oppure giunzioni dinamiche come quelle che avvengono in cellule in movimento (sangue, macrofagi ecc…) che sono non definitive ma dinamiche.
L’adesione stabile nella formazione di epiteli lega le cellule come cemento (esempio endotelio o cute) in cui le cellule non devono scollarsi. Poi avremo interazione fra cellule che possono essere di tre tipi. La prima è l’interazione omotipica in cui due cellule dello stesso tipo si legano. Esempio neuroni con N-Cam. Poi avremo cellule di tipo diverso che si devono unire come neuroni e glia (NG-Cam). Queste cellule hanno legami cellula cellula eterotipici. Un altro tipo di interazione è quella di unione tramite una molecola extracellulare di legame che può essere una proteina o uno ione a cui due cellule si legano.
Gli occhielli contraddistinguono la famiglia delle Cam. Questa struttura ripetuta è potenziata da ponti disolfuro. Il numero di occhielli determina la Cam. Le differenze in alcune Cam sono date da splicing alternativo. Le Cam più tipiche sono quelle che hanno dominio intracellulare ed extracellulare. Il peduncolo citoplasmatico da un segnale alla cellula. Una cellula che è ingaggiata in legami con cellule vicine non può dividersi e nemmeno morire, questo perché è legata. Questi peduncoli organizzano inoltre il citoscheletro della cellula. Altre Cam hanno delle forme solubili secrete che possono influire con i legami, inibendoli. Quando due cellule devono staccarsi vengono secrete delle parti solubili che indeboliscono i legami e distaccano le Cam più facilmente. Le caderine che fanno parte della terza categoria vista sopra, necessitano di calcio. Le proteine di adesione nella loro porzione citoplasmatica organizzano il citoscheletro. Quando una cellule lega un’altra cellula, questa riceve un segnale dato dall’ancoraggio al citoscheletro. In un tessuto abbiamo anche interazioni fra cellule e matrice extracellulare. Ogni epitelio avrà sotto una membrana basale. Nel connettivo sottostante avremo macrofagi, fibroblasti, mastociti. Quando noi parliamo di interazioni tra cellule e matrice dobbiamo considerare tutte queste cellule. Un vaso può entrare in contatto con altre cellule come macrofagi o fibroblasti. La matrice extracellulare è una struttura complessa fatta da proteine, zuccheri e da una sostanza liquida ricca di nutrienti. Essa deve sostenere i nostri tessuti, nutrirli. La MEC è molto importante per l’organismo. La matrice è prodotta da fibroblasti, osteoblasti e condroblasti in base al tipo di tessuto. Le componenti della matrice sono proteine e proteoglicani. Le proteine danno resistanza meccanica o interagiscono con la matrice. Avremo le proteine strutturali come i collageni e altre proteine fibrose come la fibronectina e la laminina che permettono innterazioni tra cellula e matrice. GAG = glicosamminoglicani. Le proteine devono dare sia struttura che resistenza ma anche specificità. I GAG servono in particolare a svolgere un ruolo più nutrizionale. I GAG sono fatti da proteine e zuccheri. Abbiamo la molecola di acido ialuronico come base e delle proteine su di esso che legano condroitin solfato e cheratin solfato. Gli zuccheri hanno molti OH e legano un sacco di molecole di acqua. L’acqua e i soluti vengono trattenuti da i GAG che fungono da “spugna”. Per questo i GAG hanno funzione nutritiva perchè le cellule si nutrono pescando da qui. Tutti i prodotti iniziali e di base del metabolismo saranno presenti. La matrice è un insieme di cellule che svolgono diverse funzioni, alcune costruiscono la matrice stessa, altre cellule difendono l’organismo (linfociti, macrofagi) mentre la matrice funge da supporto tramite le proteine strutturali come i collageni. E’ necessaria anche l’elastina che resiste alla pressione. Le proteine devono quindi supportare la matrice mentre i GAG servono a nutrire le cellule. Gli epiteli invece si nutrino dalla membrana basale tramite pinocitosi. Il legame alla matrice da anche la polarità alle cellule tramite particolari legami che si instaurano tra cellule e membrana basale. Anche le cellule come il fibroblasto sono polarizzate anche se non si legano alla membrana basale. La polarizzazione c’è sempre.
La proteina più abbondante nel nostro organismo è il collagene.
La fibronectina è una proteina che media il legame tra cellule e matrice extracellulare. Essa è una proteina di 2500 AA che è sempre sotto forma di omodimero cioè con due molecole identiche legate con ponti disolfuro al C-terminale. Essa si trova nella matrice extracellulare. Abbiamo diversi domini o “salciccie” che svolgono diversi ruoli. La fibronectina media l’interazione con diverse strutture come collagene, eparina e cellule. Il trimero AGD (arginina, glicina, asparagina e serina…) è tipico per le regioni di legame. Il collagene di tipo 4 si lega in un dominio particolare della fibronectina. Esso è concentrato soprattutto nelle membrane basali. La fibronectina ha diverse forme per splicing alternativo. Ogni fibronectina ha sette domini, 5 sono funzionalmente attivi e due sono strutturali. Dato che si forma un omodimero avremo il doppio dei domini. La fibronectina non lega direttamente le celllule ma lega altre molecole. La sua struttura a forcina permette di fare da ponte per due cose. Il collagene (e quindi la matrice) da un parte lega la fibreonectina che a sua volta lega le integrine che mediano il rapporto tra cellule e MEC. Le integrine sono sempre proteine di adesione che necessitano di fibronectina. La fibronectina non agisce direttamente ma si lega a proteine dette integrine fatte da una catena alfa e due beta. Le integrine interagiscono con il citoscheletro delle cellule dove si trovano. Le cellule quindi si legano alla MEC tramite integrine e fibronectine. La fibronectina si lega o al collagene o alla fibrina ad esempio. La fibrina sta nel sangue e quindi la cellula che si lega probabilmente in questo caso, sarà una cellule endoteliale. La fibronectina è presente anche nel sangue ed è importante nel processo di coabulazione del sangue. La struttura flessibile che ha la fibronectina le permette di svolgere diverse funzioni. La prima proteina di adesione importante è quindi la fibronectina. La fibronectina non serve solo a stabilizare le cellule ma serve anche a farle muovere. Questa cosa è importante nell’embriologia perché nell’embrione ci stanno molte cellule che si spostano rispetto a dove stanno. Queste cellule migrano attraverso i binari formati dalla fibronectina tramite le integrine che possiedono ed esprimono. Ciò fu dimostrato su cellule isolate. Thierry studiò le cellule delle creste neurali e come si muovono. Egli purificò varie proteine da tali cellule e le stratificò su una piastra da coltura per vedere se l’adesione delle cellule aumentava o no. Egli allora scoprì che effettivamente alcune proteine determinavano un’adesione migliore come le fibronectine. Egli fece un gradiente di fibronectina ponendo delle piastre di sbieco e facendo evaporare la soluzione contenente fibronectina. Così egli ebbe delle piastre con una concentrazione diversa di fibronectina. Egli prese le cellule delle creste neurali e le pose dove la concentrazione era massima. Osservò che le cellule crescevano e camminavano nella direzione decrescente di concentrazione di fibronectina. Quando la concentrazione era minima si fermavano. Quindi la fibronectina era fondamentale per il movimento cellulare. Un’altra cosa che le cellule facevano è che si riaggregavano e ristabilivano giunzioni fra di loro tramite proteine di adesione. L’N-Cam prima quando si staccavano le cellule andava a zero, poi quando la cellula si legava alla fibronectina continuava a rimanere a zero perché le cellule sapevano che stavano migrando, ma poi quando si fermavano l’N-Cam riaumenta venendo espresso per fomare un aggregato di cellule. La cellule in ogni momento deve sapere dove è collocata. La cellule può morire se riceve segnali diversi ed ambigui-> ad esempio se è legata tramite giunzioni e riceve un segnale di divisione. La fibronectina si lega soprattutto al collagene di tipo 4.
La seconda proteina di adesione importante è la laminina. Essa è fatta a croce nella sua struttura trilaminare. Avremo tre molecole e quindi tre catene. Una catena a e due catene b che si avvolgono a spirale. Sull’asse centrale si avvolgono due molecole uguali di catena b. Anche essa ha vari siti di legame. Il dominio per i glicani, legame al collagene ma solo di tipo 4, sito di legame per la migrazione delle cellule, abbiamo anche un AGD esposto. Questa molecola sarà presente soprattutto nelle membrane basali.
Gli ingrediente fondamentali per la matrice extracellulare sono laminina, collagene di tipo 4 e GAG. La base di tutto è la laminina. Essa è fatta a croce ed ai lati della croce si lega il collagene di tipo 4. Formeremo così un piano di molecole e sotto i GAG ai quali si legano. Sopra invece avremo le cellule che si legano. La laminina forma la base su cui si poggiano le altre molecole. La laminina è uno dei siti bersaglio delle cellule tumorali metastatiche. Una cellule tumorale deve digerire il vaso tramite proteasi che eliminano la laminina ad esempio…
Per riassumere abbiamo strutture di adesione stabili, poi proteine di adesione cellula cellula e proteine di adesione tra cellule e matrice. Nel caso della fibronectina esse fanno da ponti tra integrine e matrice extracellulare. Le integrine sono proteine di adesione che necessitano di ioni. Si legano alla fibronectina. Esse hanno un peduncolo intracellulare. Quando le integrine non sono legate avremo un’oganizzazione del citoscheletro ben diversa, più disordinata rispetto a quando sono legate alla fibronectina. L’integrina si lega all’actina tramite complesse interazioni.
Quando c’è un’infiammazione vengono rilasciate delle citochine che vanno alle cellule endoteliali facendole esprimere due tipi di selectine che rallentano e fermano i leucociti permettendone poi il passaggio attraverso il vaso.

Biologia dello sviluppo 18-12-06

Ciclo cellulare

Ogni cellula è in grado di dividersi, differenziare e morire.
La cellula in genere esce dal ciclo quando deve differenziare o morire.
Abbiamo interfase e mitosi, quest’ultima si divide in profase, metafase, anafase e telofase.
G0 e G1 sono alternative. Cellula che cicla va in G1, poi entra in S, G2 e infine mitosi. Una cellula che deve differenziare rimane in G0.
La scoperta che dentro il nucleo ci fosse DNA ha permesso di fare autoradiografia del DNA per evidenziare le cellule che ciclavano rispetto a quelle che non lo facevano. Le cellule che ciclano stanno duplicando il DNA e per questo che vengono evidenziate. La divisione tra mitosi e interfase era già nota. Dopo la guerra si riuscì a stabilizzare le cellule, e a creare prime linee cellulari trasformate e stabilizzate. A questo punto si iniziò a capire alcune caratteristiche delle cellule in coltura. C’è una differenza tra cellule così dette normali e cellule trasformate. Se mettiamo cellule normali su una piastra esse riempono la superficie e poi si fermano. Questa si chiama inibizione da contatto. Ciò è tipico delle cellule normali e non tumorali. Questa è una regolazione del ciclo cellulare. Le cellule hanno un controllo del ciclo cellulare. Le cellule tumorali continuano a crescere a dismisura senza che badino a cellule vicine attaccate o meno. Gli esperimenti che sono stati fatti erano quelli di vedere come andava il ciclo cellulare nelle cellule in coltura. E’ possibile aver in coltura una popolazione di cellule sincrona, cioè cellule che fanno la stessa cosa contemporaneamente? Per far ciò si osservavano cellule in coltura e si vedeva che quando una cellula andava in mitosi si staccava dal substrato, si sfericizzava e poi si riattaccava al substrato. Solo alcune cellule si possono attaccare da qualche parte, non tutte come ad esempio i linfociti. Una delle prime linee cellulari tumorali immortalizzate si chiamano cellule Hela. Tali cellule in interfase sono adese al substrato ma quando vanno in mitosi si scollano dal substrato e sfericizzano. Se prendiamo la piastra e la rivoltiamo possiamo separare le cellule in base al loro ciclo. La vita del ciclo cellulare prevede una mitosi breve di circa 40 minuti rispetto all’interfase che dura anche giorni. In questo modo per scuotimento è stato possibile separare le cellule. A questo punto abbiamo cellule che escono dalla mitosi più o meno insieme così come le altre fasi. Questa sinconia dura solo per un pò perché a livello della mitosi vi sono varie sottofasi.
Vari studi hanno analizzato le proteine della cellula nelle varie fasi e ci si è accorti che soprattutto nella fase G1 abbiamo alcune proteine caratteristiche del ciclo cellulare. La fase G1 è preparatoria alla fase S e serve per accumulare basi azotate e altri componenti che servono per la duplicazione del DNA. E’ stato osservato che c’era un’alternanza molto regolare di un certo tipo di proteine. Si accumulavano in G1, scendevano in concentrazione fino a scomparire durante la mitosi e poi ritornavano durante la successiva fase G1. Tali proteine prendono il nome di cicline data la loro ciclicità. Aumentano durante l’interfase e dopo la mitosi scompaiono. Esse sono una sorta di orologio biologico perché la loro quantità regola l’orologio dell’entrata in mitosi. Le cicline si alternano e regolano i vari passaggi delle fasi del ciclo cellulare. Con dei reagenti chimici è possibile fondere delle cellule (glicol etilenico). Se fondiamo una cellula in fase S con una in G1, il nucleo della cellula G1 va in fase S. Questo vuol dire che il nucleo che va avanti nella via tira a se l’altro nucleo che sta dietro. A livello della cellula c’è qualcosa che influenza i citoplasmi. Le cicline sono molto regolate anche a livello di fosforilazione e defosforilazione (Chinasi-> enzimi che fosforilano; Fosfatasi-> defosforilano), questo è un meccanismo di regolazione molto comune. Le cicline sono tante e sono state scoperte soprattutto sul lievito creando mutanti dal punto di vista del ciclo cellulare. Dei ricercatori hanno scoperto i così detti geni CDC con vari numeri a seguito. Trovando questi si poterono scoprire anche i geni coinvolti in altri organismi. I geni di mammiferi si chiamano p34 (ad esempio) inceve di CDC. Questi geni sono le chinasi e non le cicline. Durante l’interfase abbiamo varie cicline che si alternano e vengono fosforilate da p34 (nei mammiferi) o CDC 2 (nel lievito).
Una proteina, p34, fosforila e fa entrare in mitosi la cellula. In G1 la p34, che a sua volta è fosforilata, forma un complesso p34-ciclina che fosforila la ciclina. Quando si arriva in mitosi essa si stacca e quindi la ciclina fosforilata è oggetto di degradazione. Quindi dopo che la ciclina viene fosforilata e forma il complesso con p34, verrà rilasciata e degradata. La p34 desforilata da un enzima specifico rilascia la ciclina che viene degradata. E’ tale evento che determina il rilascio della ciclina che coincide circa con l’arrivo della mitosi. Per rientrare nel ciclo la cellula deve avere una chinasi che fosforila la p34 così che possa riformare il complesso con le cicline neosintetizzate dato che le altre sono state degradate. Quindi abbiamo chinasi, cicline e fosfatasi. Per questo motivo abbiamo lo schema particolare di cicline che aumentano e diminuiscono in concentrazione ciclicamente. Il complesso p34-ciclina è detto MIF (fattore che fa entrare le cellule in mitosi). P34 fosforila quando forma il complesso, quando p34 viene defosforilata stacca le cicline dal complesso che vengono degradate. Quest’alternanza regola il ciclo cellulare.
Che succede negli oociti? Se prendiamo un oocita vediamo che c’è l’MPF(fattore che promuove la mitosi) -> quasi analogo a MIF (dovrebbero essere la stessa cosa). Si osserva che c’è ne è tanto! L’MPF per essere prodotto in termini sufficienti richiede tutta l’interfase. Se le cellule dell’embrione producessero MPF perderebbero molto tempo. Per fare un’interfase ci vuole molto tempo e quindi si favorisce un accumulo di grandi quantità di MPF per risparmiare tempo. Il CSF (fattore che stabilizza le cicline) è una sorta di freno a mano, inibitore.
L’oocita produce tanta ciclina e p34 ma essi vengono stabilizzati fino a stare fermi anche per 40 anni. Questo serve per rendere veloci i primi cicli cellulari. Quando arriva lo spermatozoo c’è tutto quel casino di reazioni a catena che riguarda l’inositolo-trifosfato (IP3 che deriva dal fosfoinositol-difosfato a seguito dell’azione della fosfolipasi C) che va al suo recettore che fa uscire il calcio dal reticolo endoplasmatico (rivedi tutte le reazioni a catena). Quando il calcio viene rilasciato esso influenza vari enzimi calcio dipendenti. Tra questi abbiamo una categoria di proteasi che vengono chiamate calpaine, che vengono attivate appena dopo la fecondazione, circa un’ora dopo.
Le calpaine distruggono il fattore citostatico CSF. In questo modo grazie ai costituenti già prodotti le cellule possono dividersi rapidamente. Quando le cicline arrivano a 0 le cellule embrionali devono riaccumulare cicline da sole ma questo avviene di solito dopo la segmentazione. L’oocita quindi si carica anche di MPF. Se noi mettiamo nell’oocita un po’ di calcio attiviamo l’oocita per le cose dette prima. Le cellule embrionali durante la segmentazione non hanno l’interfase.
Abbiamo visto fino ad ora come la velocità fosse prediletta rispetto alla qualità a causa di selezione vantaggiosa. Nel ciclo cellulare normale (non embrionale) le varie fasi dell’interfase sono regolate dai così detti punti di restrizione (check point). Le cellule verificano in tali punti se tutto va bene. Ciò è importante per stare attenti a non fare errori. C’è ne è uno tra G1 e S. Oltre a quello ci stanno altri punti come quello tra G2 e M. Le cellule controllano che per entrare in S abbiano accumulato tutto quello che gli serve, come istoni, nucleotidi e nutrienti in generale. Questi punti di restrizione si basano su sensori, cioè enzimi e proteine che percepiscono se tutto quello che doveva avvenire in G1 è avvenuto correttamente. I sensori possono impedire alla cellula di andare avanti. Questi sensori sono i primi a mutare nel cancro e vengono detti oncogeni quando sono mutati. Un oncogene è una proteina mutata che perde la sua funzione e favorisce la proliferazione delle cellule tumorali. Una proteina importante PRB (proteina del retino blastoma) causa tumore a causa della sua mutazione e non rispetta bene questo punto di controllo. La PRB lega altre proteine. Un’altra è C-MYC, anche lui un oncogene importante per la regolazione del ciclo. C-MYC è una proteina in grado di capire se la situazione riguardante i nutrienti è buona. Se è buona manda la cellula avanti nel ciclo altrimenti la fa morire! E’ molto meglio eliminare una cellula che non va bene piuttosto che far andare avanti una che potrebbe causare danni. Queste proteine sono quindi molto importanti. Due proteine importanti per il check point a livello di una fase G1 tardiva sono C-MYC e PRB. Anche i virus che sfruttano le cellule sono spesso in grado di operare modifiche a livello di proteine del ciclo cellulare. Arrivate in G2 le cellule hanno un secondo check point che deve controllare che durante la fase di duplicazione non ci siano stati errori gravi. Anche quà abbiamo un sistema di proteine che controllano il DNA e vedono se la duplicazione è avvenuta bene. Queste proteine vedono se nella copiatura si sono formati dei buchi. Se il buco non è enorme queste proteine tra cui p53 (il più importante), p63, p73 (appartenenti alla stessa famiglia genica) bloccano l’entrata in mitosi. P53 è un fattore trascrizionale che fa trascrivere un gene detto p21 che lavora su chinasi e cicline, bloccando la degradazione delle cicline e quindi l’ingresso in mitosi. Nel frattempo p53 attiva le proteine del riparo del DNA che aggiungono delle basi, di solito delle A (quindi la copia non sarà identica ma almeno il buco sarà riempito). Il buco può causare grosse mutazione e danni in certi casi. Se p53 trova una voragine causa la morte della cellula. Fa sintetizzare delle proteine “promorte” che inducono la cellula ad andare a morire piuttosto che proseguire. Meglio perdere una cellula mutata che causare danni all’organismo. P53 è noto come il guardiano del genoma perché controlla se ci sono mutazioni e decide cosa fare-> o riparazione o morte.
Le cellule dell’embrione anche quando hanno cicline a livelli normali, cioè quando stanno circa a livello della gastrulazione, non fanno molti controllo in G1 e G2 ma il controllo viene fatto a posteriori perché cellule molto mutate moriranno. Solo all’organogenesi avanzata avremo un ciclo cellulare normale. L’embrione ha un ciclo cellulare particolare, esso accumula in auxocitosi MPF (=MIF) che viene bloccato dal CSF che dopo la fecondazione viene eliminato. L’interfase poi non avrà punti di restrizione.
P53 è mutato in otre il 50% dei tumori perché manderebbe a morire le cellule tumorali. P53 è incompatibile con la crescita tumorale. Se prendiamo un p53 wild type e lo mettiamo in una cellula tumorale la cellula muore. Per avere un tumore servono molte mutazioni su vari punti.
Come viene regolato il ciclo all’interno di un organismo?
Avremo una regolazione basata su fattori di crescita e recettori per questi. Questi servono a far crescere cellule in tutti i tessuti. L’acido retinoico in certi casi è un fattore di crescita. Molti fattori di crescita sono proteine che hanno recettori sulla membrana delle cellule. Se ad esempio abbiamo un epatocita in G0 e nel fegato alcuni epatociti muoiono, arriva una proteina fattore di crescita che trova il suo recettore. I fattori di crecita sono tessuto specifici. Ogni tessuto ha il suo, sono molto specifici. I fattori di crescita vengono prodotti da un’altra cellula che riceve il messaggio e produce il fattore che viene riconosciuto solo dalle cellule che hanno il recettore specifico. NGF è il fattore di crescita del sistema nervoso. Esso viene prodotto dalle ghiandole salivari. PDGF è il fattore di crescita derivato dalle piastrine. Esse producono questo fattore che stimola alcuni tessuti. EGF è un fattore di crescita importante perchè stimola molte cellule, serve anche per la formazione dell’arto durante l’embriogenesi. Queste proteine possono diventare oncogeni se vengono mutate. Un oncogene quindi non è solo una proteina all’interno della cellula ma, anche fattori di crescita e loro recettori possono diventare oncogeni. Il recettore della PDGF è una proteina transmembrana che forma un dimero con ponti disolfuro con un’altra subunità identica quando viene legato il ligando PDGF. Sotto al recettore si attiva una chinasi che allarga il recettore e fa riuscire il PDGF. Se il PDGF viene mutato forma un ponte diverso quasi a U e non lega bene il PDGF ma lo lega più giù, dentro una specie di tasca. Quando si attiva la chinasi il movimento che fa il recettore non è più sufficiente a far uscire il fattore di crescita mutato. Questo determina un costante segnale proliferativo dato che rimane incastrato al recettore. Una sola mutazione non è in grado di generare un tumore, servono più mutazioni a livello di diverse funzioni regolatorie.
Ad esempio per avere un tumore al colon servono più mutazioni. Un prima mutazione deregola il ciclo cellulare e genera i così detti polipi che rimangono bloccati a questo livello di prima mutazione. In certi casi si può avere una seconda mutazione intracellulare ed avremo un atenoma di classe seconda che cresce ancora di più. Se su questo si perde il cromosoma 18 avremo una vera displasia, poi con una mutazione al cromosoma 17 avremo un carcinoma ovvero un tumore. Per diventare un vero tumore le cellule devono staccarsi per andare in altri siti. Un’altra mutazione determina lo scollamento delle cellule che non riconoscono più le proteine di adesione. Servono quindi circa 5 mutazioni sulla stessa cellula per avere un tumore vero e proprio.

Biologia dello sviluppo appunti