Biotecnologie vegetali

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Biotecnologie vegetali

BIOTECNOLOGIE VEGETALI

TOTIPOTENZA: la possibilità di rigenerare un’intera pianta da singole cellule differenziate purchè queste cellule siano in grado di andare incontro ad un processo di de-differenziamento.

Colture: 1)cellule vegetali in coltura mantenute come protoplasti cioè senza la parete, che possono propagarsi indefinitamente e in presenza di mannitolo per evitare la lisi;
2)di tessuto:Meristemi (piccole masse in divisione presenti negli apici vegetativi), Germogli, Radici, Nodi, Embrioni, Antere (dai granuli pollinici contenuti nelle antere si sviluppano piantine aploidi che sono sterili e più piccole delle piante parentali, sono utili per evidenziare mutazioni recessive)
Sia dal tessuto che dalle cellule in coltura è possibile rigenerare una pianta

MORFOGENESI: processo di rigenerazione che avviene grazie a processi avventizi. Non è un processo che avviene in tutte le specie e in tutte le varietà di una specie, le cellule che possono dar luogo a morfogenesi sono dette COMPETENTI. La competenza è verso una specifica via di sviluppo (se è competente x sviluppo dell’embrione somatico non lo è x lo sviluppo del germoglio)
caulogenesiàgermogli, rizogenesiàradici, embriogenesi somaticaàembrioni somatici
-diretta: da cellule differenziate di tessuto senza che prolifichi tessuto indifferenziato
-indiretta: da cellule de differenziate di callo

CALLO: massa di tessuto amorfo formato da cellule non specializzate che si moltiplicano in maniera disorganizzata. Si può ottenere da cellule in coltura o da espianti di tessuto sotto lo stimolo di regolatori di crescita endogeni oche causano il de-differenziamento. dal callo si puo rigenerare la pianta. Ci sono 2 tipi di callo NODULARE o embriogenico che puo andare incontro a morfogenesi in cui le cellule sono aggregate densamente; FRIABILE non è morfogenico, le cellule sono solo accostate.

ORMONI DELLA MORFOGENESI
CITOCHININEà stimola la crescita favorendo la divisione cellulare. Sono formate tutte da un anello purifico dell’adenina e hanno un doppio legame trans o E sulla catena laterale.
Effetti: espansione fogliare, ritardo senescenza foglia, germinazione semi, sviluppo gemme.
Carenza di citochinine prova ritardo nelle formazione del germoglio, aumento velocità di sviluppo di radici e blocco del ciclo cellulare in fase G2 xche controllano l’attività di una fosfatasi che ha come substrato Cdc2 ( una CDK) che serve per indurre la mitosi

AUXINEàstimolano l’espansione cellulare, ma non tanto la divisione cellulare, crescita delle radici, inibizione della caduta delle foglie , promuovono la crescita dei frutti,determinano la dominanza apicale:tendenza a crescere verso l’alto, le auxine prodotte dalla gemma apicale inibiscono lo sviluppo di gemme laterali.
Derivano dal triptofano , la più comune è l’acido indolacetico IAA( naturale), ci sono anche NAA e 2,4-D che sono sintetiche.
carenza di auxina provoca arresto del ciclo cellulare in fase G1 perché l’auxina stimola la formazione di Cdc2 e la transizione dallo stato G1 allo stato S richiede un corredo di ciclone tra cui c’è Cdc2.

Alti livelli di Citochinine e bassi livelli di Auxinaàformazione di germogli in calli in coltura.
Bassi livelli di Citochinine e alti livelli di Auxinaàsviluppo di radici.
Concentrazioni uguali di Auxine e Citochinineà sviluppo, nelle dicotiledoni, del callo.

PROPAGAZIONE VEGETATIVA: riproduzione asessuale, la progenie è formata da cloni. Si puo avere grazie a frammentazione (cactus), stoloni (fragola), talea=da una parte della pianta si induce formazione di radici con Auxina e si forma una pianta nuova, micropropagazione= da gemme apicali, ascellari, foglie, internodi, radici, colture in sospensione o calli si induce la formazione di germogli (germogli avventizi) o di embrioni somatici
vantaggi: x piante che non si posso propagare altrimenti, poco spazio, assenza di batteri, funghi e virus, indipendente da stagione vegetativa, si possono variare i fattori di crescita, le piante posso acquisire nuove caratteristiche. svantaggi: periodo di adattamento richiesto, suscettibili alla perdita di H20, variazione somaclonale: le piante che derivano da embrioni somatici possono avere caratteristiche diverse a causa di mutazioni e riarrangiamenti. Questa variazione può essere epigenetica ( solo nella pianta e non nella progenie) o ereditabile. Puo essere sfruttata per ottenere nuove varietà con caratteristiche desiderabili ( ma oggi non si usa piu fare cosi).

ARABIDOPSIS THALIANA
pianta modello, ciclo viatale rapido 6 settimane, germogli dopo 3 settiamne, forma a rosetta, dimensioni ridotte diametro 2-10 cm. fiori porta sia gameti maschili che femminili, sono lunghi 2-3mm e larghi 0.5-1mm, con fecondazione ovari si allungano a formare silique, frutti contengono 30-60 semi piccolissimi quindi da una pianta anche 5000 semi. E’ autofertilizzante ma si puo incrociare in laboratorio con la cross-fertilizzazione ( togliendo gli stami col polline e applicando sullo stigma il polline di un'altra pianta).
Genoma piccolo perché ci sono poche ripetizioni e ci sono in ogni gene pochi introni e molto piccoli; genoma interamente sequenziato 5 cromosomi, contenuto aploide di 125Mb.64% geni si sa anche la funzione
Facilmente trasformabile.

PER CAPIRE FUNZIONE DEI GENI:
-GENETICA TRADIZIONALE: dal fenotipo risalgo al gene da clonare
-GENETICA INVERSA: da un gene di sequenza nota vado a vedere quale fenotipo produce, di solito faccio il mutante knock out del gene e vedo gli effetti sul fenotipo

MUTAGENESI
- se sono mutati i semi non tutte le cellule del seme avranno la mutazione. Per avere poi piante omozigoti per la mutazione si devono prendere le piante prodotte dalla autoimpollinazione di quei fiori che derivano dal settore mutato nel seme.
*indotta da agenti chimici: agenti alchilanti come EMS che alchila le G e le fa appaiare con T
*indotta da agenti fisici: radiazioni αβγ, raggi X, UV
*per inserzione di DNA esogeno:nel genoma della cellula l’inserzione avviene a livello di un gene che codifica per una proteina che cosi non viene piu prodotta correttamente= interrompe il frame di lettura del gene. Il DNA inserito è DNA TRASPOSONE o un T-DNA di Agrobacterium.

TRASPOSON TAGGING
elementi trosponibili di mais, il gene per la traspostasi e l’elemento non autonomo sono indotti separatamente ( su 2 cromosomi diversi) perché vengono incrociate 2 linee omozigoti per i due elementi. Dalla progenie F1 si procede alla autofecondazione e si recupera dalla F2 quelle piante che hanno l’elemento trasponibile ma non la traspostasi. La selezione si puo fare se si usa un elemento marcatore associato all’elemento trasponibile.
Ho una sola inserzione nel DNA; posso rimobilizzare il trasposone se reincrocio con una pianta che ha la traspostasi.

Come si vede se il fenotipo è dovuto alla mutzione?
1)TEST DI CO-SEGREGAZIONE:
uso dei marcatori associati al trasposone o al T-DNA. Se il fenotipo è connesso con la mutazione allora ho anche l’effetto del marcatore. ( se è una resistenza all’antibiotico la pianta è anche resistente all’antibiotico)
2)DETERMINAZIONE DEL T-DNA CON PCR
Se il fenotipo mutante è letale devo fare una PCR sul DNA cromosomale usando oligont che amplificano la regione del DNA esogeno. Si puo fare la PCR di una singola pianta o la PCR su tutte le painte costruendo dei pool di dna provenienti da campioni diversi ( 10 pool riga, 10 pool colonna ogni pool ha il DNA di 10 sottopool, ogni sotto pool contiene DNA di 10 piante)

Come si vede quale gene è stato mutato dall’inserzione?
1)PCR INVERSA (GENETICA TRADIZIONALE)
conosco il dna inserito, vado a cercare le sequenze fiancheggianti il dna inserito nel genoma.
Identifico due siti di restrizione nel T-DNA, taglio con l’enzima di restrizione A e ottengo un DNA lineare con estremità coesive ( il taglio avviene anche nel dna cellulare). Uso ligasi e circolarizzo il frammento ottenendo un plasmide. Taglio il plasmide con l’enzima di restrizione B che forma estremità piatte e cosi ottengo una sequenza lineare che ha ai lati le sequneze del T-DNA e al centro parte del gene incognito. Uso oligo nt basati sulla sequenza del T-DNA e effettuando PCR amplifico la regione incognita che poi viene seuqenziata e inserita in una banca dati.

2)PLASMIDE RESCUE /GENETICA TRADIZIONALE)
inserisco nel T-DNA una sequenza plasmide (OR e resistenza da un antibiotico). Dopo integrazione del costrutto recupero il plasmide digerendo con un enzima di restrizione che non ha siti dentro il T-DNA. Il frammento viene circolarizzato con ligasi e usato per trasformare coli. Il plasmide con il T-DNA si replicherà in coli e con selezione su terreno contenente antibiotico recupero colonie. Dalle colonie recupero i plasmide e si trova la sequenza.

3) COMPLEMENTAZIONE FUNZIONALE ( GENETICA TRADIZIONALE)?
Un gene vegetale ripristina il fenotipo wt in un ceppo di lievito mutante

Come si puo mutare uno specifico gene?
Non si puo fare, si devono mutare un gran numero di piantine e poi si va a vedere se in qualcuna ho mutato il gene che mi interessa. Lo si fa con PCR su DNA usando primer complementari ad un tratto del gene che voglio mutare e primer complementari alla sequenza del T_DNA che ho inserito per mutagenizzare. Se ho amplificazione con PCR allora in quella piantina il T-DNA è stato inserito nel mio gene.

MUTAZIONE LOSS of FUNCTION: fenotipo dipende dalla perdita di funzione del gene, recessive
MUTAZIONE GAIN of FUNCTION: fenotipo dipende dall’acquisizione di una nuova funzione assente nel wt, dominante.
MUTAZIONE EPISTATICA: mutazione che puo mascherare il fenotipo di un'altra mutazione sostituendolo con il proprio. Queste mutazioni sono utili per determinare la posizione di un componente rispetto ad un altro della stessa via.ES: ctr1 è epistatico rispetto a etr1 perché nel doppio mutante etr1-1/ctr1 osservo il fenotipo di ctr1

VIA DI TRASDUZIONE DELL’ETILENE:
ETILENEà ormone vegetale, induce nelle piante risposta tripla: ridotto allungamento del fusto, aumento accrescimento laterale, accrescimento orizzontale anormale.
Si lega a recettori ETR1. Se non c’è etilene ETR1 non è legato e attiva la proteina CTR1 che blocca la risposta all’etilene (la trascrizione dei geni responsabili della risposta tripla), se c’è etilene ETR1 viene legato e non attiva CTR1 così si ha risposta tripla.
Non c’è solo ETR1 come recettori ma ce ne sono anche altri che funzionano allo stesso modo ( legano l’etilene e attivano CTR1)

La via di traduzione dell’etilene è stata identificata analizzando dei mutanti. Il mutante etr1-1 era insensibile all’etilene e non mostrava mai risposta tripla. La mutazione è di tipo gain of function perché il mutante non riconosce l’etilene e causava sempre l’attivazione di CTR1. Il mutante etr1-2 dava sempre risposta tripla anche in assenza di etilene perché non riconosceva CTR1 e quindi non lo attivava mai. Questa è una mutazione loss of function di etr1. Per dare sempre risposta tripla però anche gli altri recettori devono essere mutati.
Il mutante ctr1 dava sempre risposta tripla anche in assenza di etilene in modo costitutivo

Come si studia l’espressione dei geni ( rispetto a condizioni ambientali e di sviluppo)?
1) DIFFERENTIAL DISPLAY
estraggo il DNA da piu piante mutate e da una pianta wt, Faccio trascrizione inversa dell’mRNA con oligodt e primer random. Ottengo un cDNA di frammenti diversi che amplifico con PCR. e separo mediante ettroforesi. Con una autoradiografia vediamo quali geni erano upregolati, quali inalterati e quali downregolati( confronto con la pianta wt). Si estrae quindi la banda dal gel, si clona e si va a sequenziare per vedere che gene era.
2)DNA MICROARREY
Si estrae RNA dalla pianta controllo e dalla pianta sottoposta a stress, Gli rna vengono marcati con sostanze fluorescenti diverse e vengono poi fatti ibridare con un cip di DNA che contiene tutti i geni dell’organismo che si sta studiando. Quando l’RNA lega il gene da fluorescenza. In base all’intensità della fluorescenza si sa il grado di espressione del gene, in base al colore della fluorescenza so se quel gene è espresso da una o da tutte e due le piante

DOMESTICAZIONE: processo per cui una specie viene trasferita da una situazione naturale ad una che prevede l’intervento dell’uomo su alcune funzioni fisiologiche (nutrizione, riproduzione). Lo scopo della domesticazione è quello di far subire ad una specie quelle mutazioni genetiche che la rendano sempre più adatta a soddisfare le esigenze dell’uomo ma le mutazioni che si accumulano non la rendo piu in grado di crescere spontaneamente.
Esistono 6 centri di domesticazione: mesopotamia, sud-est asiatico, indocina, altopiani etiopi, mesoamerica, zona ande. In ogni centro sono state domesticate piante con caratteristiche diverse. In ogni centro è stato domesticato un cereale e un legume.
La domesticazione ha portato ad una perdita di diversità tra le specie coltivate anche a causa dell’uniformità delle richieste. Un rimedio è lo sviluppo di programmi per la conservazione in situ (nei luoghi di origine) e ex situ ( semi in azoto liquido e propagazioni in vitro)delle specie vegetali

PLANT BREEDING: miglioramento genetico vegetale- queste tecniche sono considerate naturali e non producono OGM
1) Selezione artificiale:
la domesticazione delle piante ha portato alla selezione di quelle piante con caratteristiche desiderabili per l’uomo con lo sviluppo di razze locali. La mutazione è alla base della diversità.
Il limite a questo tipo di miglioramento è che le mutazioni sono eventi rari e casuali e a volte la mutazione produce un cambiamento non desiderato.
Le piante selezionate sono diverse dai loro progenitori wt e in particolari ci sono alcuni caratteri che si ritrovano in tutte le piante domesticate (SINDROME DA DOMESTICAZIONE):
- disseminazione dei semià l’uomo ha selezionato varietà (es di frumento, mais, legumi) che avevano una disseminazione difettosa per aumentare il raccolto
- dormienza dei semiàpiante che non hanno una dormienza lunga per farle germinare prima
- modalità di crescitaà selezionate piante con crescita piu compatta e meno ramificata perché non devono competere per lo spazio
- gigantismo degli organi raccoltià selezionate piante con frutti e semi piu grandi e colorati
- perdita resistenza a malattieàhanno perso la possibilità di produrre composti tossici come alcaloidi, tannini ecc.
- passaggio da pianta annuale a perenne
-perdita produzione frutti (nella patata)
- perdita produzione semi (agrumi)
2)Incrocio controllato
aggiungere geni da una varietà ad un’altra attraverso la cross – impollinazione per migliorare la specie. La cross impollinazione è favorita da mutazioni che causano sterilità del polline perché prevengono autoimpollinazione. Spesso l’incrocio avviene tra pianta modificata e progenitore selvatico ( soprattutto per caratteristiche di resistenza a patogeni) che fanno parte dello stesso pool genetico GP1.
L’incrocio o l’ibridazione crea variabilità. Una volta ottenuta una pianta ibrida F1 con caratteristiche vantaggiose questa viene propagata per via vegetativa perché i semi raccolti danno piante con caratteristiche diverse ( Vigore ibrido: caratteristiche degli ibridi F1 che si perdono nella segregazione).
Allopoliploidiaàpoliploide formato dall’unione di 2 correi cromosomici, il vantaggio è che geni di origini diverse danno caratteristiche utili ( adattamento a condizioni ambientali diverse, piu copie del gene, nuovi tratti). Di solito queste specie hanno foglie, semi, frutti ecc piu grandi.
Re-incrocio(back crossing)àper cercare di inserire solo il gene di interesse si fa un primo incrocio e si seleziona la varietà che ha acquisito il gene di interesse ma anche altri geni e si fa reincrociare questa varietà con il progenitore di cui si vogliono mantenere maggiormente i caratteri. Il tutto si ripete piu volte finchè non si selezione quasi esclusivamente il gene di interesse ( esempio: tratto fusto corto nel frumento)
svantaggi: tempi lunghissimi, limitazione del germoplasma (non posso incrociare tt le specie)
3) Massimilizzazione della variazione in laboratorio
-a- induzione di mutazioni per migliorare la selezione artificiale ( mutation breeding). Si usano raggi X e γ su semi che formeranno chimere ( mutazione solo in certe cellule). Si puo fare anche su polline. Non si vede che gene si inattiva ma solo l’effetto fenotipico.
-b- recupero embrionale per aumentare l’incrocio controllato: nell’incrocio interspecie tra GP3 la fertilizzazione spesso avviene ma l’embrione non si sviluppa per incompatibilità con il tessuto materno. Si recupera così l’embrione e lo si fa sviluppare in vitro.
-c-ibridazione somatica per aumentare l’incrocio controllato: nell’incrocio tra specie GP4 si procede con la fusione di cellule somatiche. Si usano protoplasmi e con passaggi in vitro si rigenera l’ibrido. La frequenza di fusione è bassa.

Pool genetico: GP1à pianta e progenitore, GP2à specie incrociabili ma con % successo bassa e progenie sterile, GP3àspecie incrociate difficiilmente, GP4àspecie i ciu geni sono trasferiti solo con ingegneria genetica

GREEN REVOLUTION
fenomeno dell’incremento della produzione di grano e di riso nel mondo (anni 70) dovuto alla coltivazione di varietà che avevano caratteristiche di produttività molto superiori alle precedenti e che davano un alta resa e dall’uso di nuovi fertilizzanti chimici.
Le nuove varietà hanno alta resa, maggiore velocità maturazione, resistenza ruggine, maggiore adattabilità alle condizioni ambientali.
VARIETA’ SEMI-NANE ( fusto corto)àhanno una mutazione nel gene per la sensibilità alle giberelline che favoriscono l’allungamento del fusto. La mutazione era nei geni Rth-B1 e Rth-D1 del grano, ortologhi al gene GAI di Arabidopsis. La risposta all’ormone viene repressa e la pianta non cresce.

PGM: PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE
piante in cui è stato introdotto una o piu copie di un gene di interesse proveniente da un organismo diverso o da un organismo della stessa specie.
NON SONO CONSIDERATE PGM QULLE PIANTE OTTENUTE CON MUTAGENESI, RECUPERO EMBRIONALE O FUSIONE DI PROTOPLASTI.

Metodi di TRASFERIMENTO INDIRETTO del DNA
Agrobacterium tumefaciens
Batterio del suolo, Gram negativo, infetta numerosi generi di piante, in particolare le dicotiledoni.
Quando una piante è ferita essa rilascia composti fenolici attrattori come l’ACETOSIRINGONE. La ferita viene infettata da A. Tumefaciens e l’acetosiringono attiva la trascrizione dei geni Vir del plasmide Ti. In questo modo viene trasferita nella cellula una porzione di DNA chiamato T-DNA presente nel suo plasmide Ti.
-- Il T-DNA contiene una serie di geni tra cui ci sono quelli per la sintesi delle opine che sono usate dal batterio come forma di nutrimento. Diversi ceppi di A. Tumefaciens producono opine diverse ( 20 tipi) e caratterizzano in questo modo i ceppi stessi.
Oltre a questi geni nel T-DNA ci sono i loci Shi e Roi che contengono dei geni per la sintesi di Auxina e Citochinine. Infatti se questi loci vengono colpiti da mutazione causano rispettivamente tumori germoglianti (induzione dei coleottili) e formazione di radici.
I mutanti SHI non sintetizzano Auxina e le Citochinine che cosi prevalgono determinano la formazione di germogli nel tumore. Nel locus SHI ci sono 2 geni IAAM e IAAH( geni tms) che sono coinvolti nella sintesi di Auxina.
I mutanti ROI non producono citochinine e quindi l’Auxina fa sviluppare radici nel tumore. Il locus Roi contiene un gene chiamato GENE 4 ( gene tmr) che codifica per IPT che serve per la sintesi delle citochinine. Ai confini del T-DNA ci sono le regioni LB e RB che servono per l’integrazione del T-DNA nell’ospite.
--geni ORI: origine di replicazione del plasmide Ti
--I geni Vir servono per trasferire e integrare la regione del T-DNA nel genoma della cellula ospite ma non vengono trasferiti con il T-DNA. Ci sono piu geni:
VirAà è l’accettore per l’acetosiringone;
VirGà serve per tradurre il segnale e si attiva quando VirA lega l’acetosiringone;
Vir Dà taglia il DNA;
Vir Eà lega il DNAss e protegge il T-DNA durante il trasferimento;
VirBà lega ATP e forma un canale per far passare il T-DNA ( il T-COMPLEX).
**Formazione del T-DNA:
VirA si autofosforila quando lega l’acetosiringone e poi trasferisce il fosfato ad una Asp di VirG.
VirGsi attiva e funge da attivatore trascrizionale per la trascrizione degli altri geni Vir come VirD. Vir D1 riconosce le LB e le RB del T-DNA e taglia il singolo filamento a livello della RB al 5’ del T-DNA, qui si lega VirD2. Il 3’è libero e parte la sintesi del DNA che copia il pezzo del T-DNA sul plasmide. Una volta copiato il tratto al 3’ del T-DNA a livello della LB ho il secondo taglio sul singolo filamento da parte di VirD1. Si è staccato il T-DNA ss che viene ricoperto da molecole di Vir E (20 kb di DNAss vengono ricoperti da circa 600 molecole di VirE2). Si forma il T-COMPLEX che passa attraverso il canale formato da VirB.
**Entrata nel nucleo:
Le molecole VirD2 e Vir E2 possiedono segnali di localizzazione nucleari (NLS) che permettono al T-DNA di entrare nel nucleo.
**Integrazione del T-DNA nel genoma vegetale:
Avviene con un meccanismo di ricombinazione illegittima sito specifica. Il T-DNA trova una regione di omologia con il DNA vegetale, si appaia e viene rimossa la regione vegetale mentre si integra il T-DNA. Il 3’ del T-DNA richiede un omologia di 5 basi, la trova, si appaia e taglia il DNA bersaglio sul ds. Il 5’ del T-DNA richiede un omologia di 1 base, si appaia e taglia il DNA bersaglio sul ds. Ho il T-DNA su un filamento e un buco sull’altro filamento. Tale buco viene riparato ricopiando il T-DNA sull’altro fialamento.
+++Come sfruttare Agrobacterium+++
posso inserire il gene di interesse nel T-DNA tra le LB e RB.
-clonazione del gene: Il gene di interesse è un c-DNA che ottengo: 1) facendo uno screening di una library di DNA se ho la sequenza del gene; 2) trascrivendo c-DNA a partire da un mRNA con RT PCR. Si usano primer che al loro interno contengono 2siti di restrizione diversi. Si inserisce il c-DNAin un plasmide che viene mantenuto in Coli. Coli si replica e il plasmide di amplifica. Si estrae il plasmide e si digerisce con i 2 enzimi di restrizione che avevo usato. I Frammenti che si formano vengono inserti nel vettore binario o cointegratico che vengono digeriti con gli stessi 2 enzimi di restrizione.
-scelta del plasmide: Ti è troppo grande, non si replica in coli, sintetizza opine che non servono per trasformare le piante e produce tumori x cio non si puo utilizzare. Si usano dei sistemi:1) SISTEMA DEL VETTORE BINARIO: Si usano 2 plasmidi, un plasmide Ti disarmato che non contiene il T-DNA e un vettore binario che contiene una OR di Coli, una OR di Tumefaciens, un marker di selezione batterica, e tra le due RB e LB un marker di selezione vegetale e il gene di interesse. Questo vettore binario è piccolo 10-13 kb e facilmente manipolabile. Il plasmide Ti disarmato serve per fornire i genbi Vir per far integrare la regione compresa tra LB e RB; 2) SISTEMA DEL VETTORE COINTEGRATIVO: Si usano due plasmidi, un plasmide Ti disarmato che ha una regione di omologia con il vettore cointegrativo e la LB, e il vettore cointegrativo che contiene la regione di omologia, il gene target, il marcatore di selezione vegetale , la RB, il marker di selezione batterica e la OR di Coli. All’interno di A. Tumefaciens i due plasmidi ricombinano
Nota bene che il vettore binario e il vettore cointegrativo che contengono il gene target si trovano in cellule di E.Coli mentre ilk plasmide Ti disarmato in quelle di Agrobacterium. Quindi devo inserire il vettore binario o cointegrativo nelle cellule di Agrobacterium per poterli avere entrambe.
-inserimento dei vettori binario o cointegrativo in Agrobacterium: si puo fare in 2 modi: 1) con la coniugazione TRIPARENTAL MATING sfruttando un plasmide helper che favorisca coniugazione tra coli e Tumefaciens mobilizzando il plasmide di Coli; 2) con ELETTROPORAZIONE in cui un campo elettrico forma temporaneamente dei pori nella membrana plasmatica
-selezione delle colonie di tumefaciens che hanno preso il plasmide: si sfruttano le resistenze agli antibiotici
-trasformazione delle piantine: si usano per lo piu espianti di tessuto. Si incuba, si co-coltiva l’espianto con Agrobacterium T, gli espianti vengono poi posti su terreno che contiene fattori di crescita che inducono formazione del callo e antibiotici non tossici per la pianta ma che uccidono agrobacterium. Si cambiano le concentazioni degli ormoni e si induce la formazione di germogli e di radici.
-selezione delle piante: si aggiunge antibiotico o erbicida nella fase di formazione del callo, cosi si sviluppano solo le piante che hanno acquisito il costrutto.
+++VANTAGGI++
efficace, espressione stabile, numero copie di plasmide inserite basso.
++SVANTAGGI++
solo poche specie sono infettabili con agrobacterium, richiede la coltura di tessuti.

Metodi di TRASFERIMENTO DIRETTO del DNA
sistema biolistico: accelerazione di particelle metalliche d’oro o di tungsteno ricoperte del DNA che deve essere trasferito. Queste particelle vengono accelerate con un particolare dispositivo. Penetrano la parete cellulare senza danneggiarla troppo e rilasciano il DNA che viene inserito nel genoma vegetale. L’integrazione avviene con un meccanismo di ricombinazione illegittima sito specifica. L’efficienza non è del 100% quindi serve un marcatore di selezione per vedere quali piante hanno ricevuto il genen target. Vantaggi: efficiente, si puo usre per qualsiasi specie, si possono inserire molti geni. Svantaggi: richiede la coltura di tessuti, si integra tutto il plasmide e non solo il gene, puo causare riarrangiamenti del DNA.
-trasformazione pulita: sistema biolistico in cui il DNA da inserire nella cellula vegetale non è un plasmide ma solo la cassetta del transgene. Il vantaggio è che inserisco solo il gene che mi serve, lo svantaggio è che questo DNA è piu facilmente degradabile e l’efficienza si abbassa.
-uso dei geni killer a monte e a valle del transgene. Le piante che crescono e che hanno il transgene hanno integrato solo quello.
-trasformazione agrolistica: consiste nell’utilizzo di tre diversi plasmidi tutti inseriti con il metodo biolistico; plasmide che porta il transgene ha anche le sequenze left e right borders; per quanto riguarda gli altri due plasmidi, uno porta il gene che codifica per Vir D1 e l’altro porta il gene che codifica per Vir D2. Una volta che vengono inseriti questi tre plasmidi, Vir D1 e Vir D2 sono in grado di riconoscere le sequenze che delimitano il transgene (LB e RB) e quindi di rimuovere questo transgene dal plasmide e di favorire l’integrazione all’interno del genoma della cellula vegetale con un meccanismo analogo a quello di Agrobacterium.
trasformazione protoplasmi con elettroporazione: poco costoso, facilmente utilizzabile ma i protoplasmi sono difficili da mantenere
microiniezione: efficienza molto bassa nelle piante

Quando si trasforma una pianta con metodi diretti o indiretti si deve partire da un espianto di tessuto che deve essere coltivato e da cui poi si rigenera la pianta. Cio non accade con la TRASFORMAZIONE IN PLANTA ( Arabidopsis).
Si usa A.Tumefaciens e si puo fare:
1) Trasformazione diretta dei semi: si co-coltivano dei semi con una sospensione di A.Tumefaciens in presenza di Acetosiringone che favorisce l’attivazione dei geni Vir ( spesso l’incubazione viene effettuata sotto-vuoto), il seme viene poi fatto germinare e la pianta che si ottiene sarà una pianta transgenica. resa 5%.
2) Inoculazione del DNA all’interno della pianta: rimosso il germoglio apicale e il tessuto meristematico ferito che rimane viene infiltrato con una sospensione di A. Tumefaciens; resa del 5% ( 5% dei germogli trasformati).
3) Infiltrazione all’interno del fiore: l’immersione dei fiori nella sospensione batterica o l’infiltrazione sotto-vuoto nel periodo della fertilizzazione. si producono semi transgenici. Resa bassa ma maggiore delle altre 2. E’ stata eseguita con successo anche su altre specie vegetali.

Selezione delle piante trasformate viene effettuata utilizzando marker di selezione
-Resistenza ad un antibiotico: esempio gene nptII della NEOMICINA FOTOTRASFERASI da resistenza alla Neomicina e alla Kanamicina
-Resistenza ad un erbicida: esempio il gene EPSPS per il 5-enolpiruvil shikimato 3 fosfato sintasi da resistenza al Glifosato
-Gene reporter: si evidenziano con saagi in situ o in virìtro. Per i saggi in situ si usa molto il gene GUS della β-glucoronidasi che quando idrolizza i glucoronidi da una colorazione blu. Si usa anche il gene LUC della luciferasi ma è molto costoso in termini energetici per la pianta.
Si puo usare anche la GFP che ha fluorescenza intrinseca sottoposta a luce blu (fluoresce nel verde) ma da segnali deboli.La GFP fluoresce perche tre aa sottoposti a luce blu ciclizzano e poi riemettono luce ad energia minore.

PROGETTAZIONE DEI COSTRUTTI
-LB e RB di 25 pb alle estremita, servono per essere riconosciute da vir
-cassetta del gene X: promotore-gene X-terminatore
-cassetta del gene marcatore o reporter: promotore-gene marcatore-trerminatore
**Scelta del Promotore**
promotore costitutivoà sempre attivo, ovunque e in qualsiasi momento dello sviluppo. esempio CaMV 35S assicura livelli elevati perché è forte ( virale), promotore dell’actina del riso, promotore dell’ubiquitina di mais, promotore della nopalina Nos di Agrobacterium
promotore tessuto specificoà inducibile solo in alcuni tessuti
promotore inducibileàil gene viene espresso solo in particolari condizioni, spesso si usa per il gene è tossico per la pianta. ci sono promotori inducibili con il calore, in caso di anaerobiosi, in presenza di luce ma anche da sostanze chimiche [1. espressione inducibile da tetraciclina:il gene x viene trascritto solo se metto tetraciclina perche questa si lega al repressore del gene x e lo inattiva; 2. promotore inducibile da steroidi: il fattore Tf di trascrizione lega le HSp se non c’è l’ormone e non puo funzionare,s eaggiungo l’ormone questo lega la HSP liberando TF e attivandolo per la trascrizione del gene X; 3. vettore XVE: la proteina di fusione XVE si lega alle HSP ma se aggiungo estrogeni si libera e attiva la trascrizione dei geni X.
**Terminatore**
Di solito si usa il terminatore NOS ter della Nopalina sintasi

VETTORI BINARI IN COMMERCIO
-pBI121: RB e LB, cassetta del marcatore = NOS-pro + gene NTPII (KanR) + NOS-ter, cassetta del gene x= 35S + gene GUS + NOS-ter.
Il gene Gus viene sostituito con il nostro gene X grazie a siti di restrizione o si fa in modo di avere una proteina di fusione con Gus inserendo il gene X in frame con il gene gus

TRASFORMAZIONE DI POMODORO CON AGROBACTERIUM
1) sterilizzare i semi per eliminare funghi e muffe con ipoclorito e porre su piastra con nutrimento
2) crescita piantine per 7 gg poi prelevare cotiledoni
3) taglio dei cotiledoni alla base e all’apice
4) periodo di adattamento in piastre con nutrienti per far riprendere le piante dallo stress
5) esposizione a Agrobacterium per 30’
6) espianti mantenuti in co-coltivazione per circa 2 gg
7) espianti posti in terreno nutriente con antibiotico CARBENICILLINA per uccidere Agrobacterium e KANAMICINA per selezionare le piante trasformate. Queste formano i calli
8) calli posti su terreno fresco nutritivo per formare germogli
9) plantule trasferite su mezzo che contiene Auxine per la radicazione
10) piastrine trafrerite in terra in contenitori chiusi ( periodo di acclimatazione)
11) piante trasferite uin terra all’aperto

come si vede quanto tra gene è stato inserito?
Southern Blotting, si digerisce il DNA con 5 enzimi di restrizione diversi, si fa elettroforesi e si trasferisce su cellulosa il DNA migrato, La cellulosa viene incubata con sonda marcata di DNA del gene X, autoradiografia e si vede il numero delle copie.

ESPRESSIONE TRANSIENTE
Si ha se il transgene non viene integrato stabilmente e non viene trasferito alla prole. Si puo avere espressione transiente con diverse tecniche .
-Uso di Vettori virali: quando viene trascrittoo il genoma virale a rna viene trascritta anche la nostra proteina. I vantaggi sono che ci sono alti livelli di espressione del gene, l’introduzione del gene è facile e non c’è effetto di posizione perché non si integra. Gli svantaggi sono i sintomi virali, l’alta velocità di mutazione spontanea.
-Agroinoculazione: clono il genoma virale e lo inserisco in un vettore binario con il transgene, inserisco il vettore in Agrobacterium e con questo faccio agroinoculazione ( traformazione in planta)

APPLICAZIONE PGM: RICERCA DI BASE
Capire il ruolo di un gene andando a vedere cosa succede se si sovraespime o si sottoesprime.
*OVERESPRESSIONE di un gene*
si trasforma la pianta con un costrutto che contiene quel gene sotto il controllo di un promotore costitutivo e che abbia come marcatore il gene per resistenza alla Kanamicina.
Si analizza il fenotipo, per essere sicuri che il fenotipo dipende dal gene si vede se il gene è espresso attraverso Northern blottig dell’mRNA o Western blotting delle proteine.
NB:A volte puo accadere che si è inserito a livello di una zona che non fa trascrizione attiva e quindi l’mRNA non viene prodotto.
NB2: a volte ho l’effetto opposto ( vedi silenziamento)
*RIDUZIONE DELL’ESPRESSIONE di un gene*
si fa di solito con la strategia antisenso. Si inserisce nel costrutto il gene da regolare con orientamento inverso rispetto alla copia presente nel genoma. Si forma un mRNA che si va ad appaiare con l’mRNA endogeno formando un RNAds che viene degradato da RNasi. Rimangono cmq livelli bassi di gene endogeno.
*SILENZIAMENTO GENICO*
A volte introducendo ulteriori copie di un gene già presente nel genoma della pianta si può ridurre l’espressione del gene invece di amplificarla. Ci sono 2 tipi di silenziamento:
1) TGS Transcriptional Gene Silencing blocco a livello di trascrizione
2)PTGS Post – Transcriptional Gene Silencing o RNAinterference:
Si formano RNAds che vengono taglaiati da enzimi DICER formando siRNA. RISC riconosce i siRNA e separa i due filamenti: uno viene degradato e l’altro di appaia ad un mRNA complementare, fa da innesco per la sintesi di RNA e forma un RNAds che poi viene tagliato da DICER formando altri siRNA causando un amplificazione del processo.
*SILENZIAMENTO GENICO INDOTTO DA VIRUS*
Quando un virus a RNAss cerca di replicare nella cellule il meccanismo dell’RNAi taglia l’RNAds ma se il virus contiene sequenze omologhe a geni vegetali, gli rna dei geni vegetali verranno legati da siRNA e i geni stessi verranno silenziati.

A che serve l’RNAi nelle piante?
1) Per regolare l’esopressione di alcuni geni: la pianta produce miRNA di 22 nt che sono una classe di mRNA che si appaiano a mRNA endogeni per regolare l’espressione e impedire ulteriore sintesi
2) per difendersi dall’infezione virale di virus ssRNA: questi devono diventare a dsRNA e quando lo fanno la pianta li taglia.

Come si puo sfruttare l’RNAi?
Se voglio bloccare l’espressione di un gene posso creare costrutti in cui ho il promotore, il gene x messo in orientamento +, uno spacer per fare il loop e di nuovo il gene x messo in orientamento -; se nella regione dello spacer metto un introne ho un efficienza maggiore perché si forma un perfetto RNAds che viene riconosciuto e taglaiato da DICER in siRNA che vanno a bloccare gli mRNA endogeni del gene x.

RNA SILENCING TRANSIENTE
Uso un vettore virale con un frammento di DNA omologo. Il Dna non si integra e l’espressione è transiente.

L’RNAi o RNA silencing a lungo andare si diffonde in tutta la pianta perché i siRNA passano attraverso i plasmodesmi e si diffondono tra le cellule

Come si vede dove nelle pianta il gene x è espresso di solito?
Si fa un costrutto in ciu si mette LB, RB, la cassetta del marcatore e nella casseta del gene x si mette il promotore di x e un gene reporter ( no x!!!!! ma GUS) e il terminatore. Il reporter ci indicherà dove il promotore funziona ( in che tessuto).

ERBICIDA:sostanza che ha una attività letale o tossica per la pianta (interferisce con biosintesi di aa,lipidi, carotenoidi, inibisce fotosintesi o la divisione cellulare), a basso costo, facilmente utilizzabile e non nocivo per gli altri organismi.
2 tipi: PRE-EMERGENZAàbloccano le prime fasi di sviluppo della pianta e per questo viene somministrato prima che appaiono le piante infestanti; POST-EMERGENZAà interferiscono con i processi metabolici per la crescita, spruzzati sulle erbe il crescita.
++ROUDUP o GLIFOSATO:
fosfonmetilglicina ( glicina+gruppo metilfosfonico), ad ampio spettro, pre e post emergenza, inibisce la sintesi degli aa aromatici perché inattiva l’enzima EPSPS che converte lo shikimato-3-fosfato in 5-enolupiruvil shikimato-3-fosfato. Non è tossico per gli animali e per l’uomo perché non hanno tale enzima.
Strategie x Resistenza:
1) sovraesprimere il gene EPSPS;
2) inserire un gene EPSPS mutato che non è sensibile al glifosato come il CP4 di Agrobacterium Tumefaciens. Ciò è stato fatto per la soia GST 40-3-2: costrutto con promotore 35S, sequenza di transito nei cloroplasti+gene CP4-EPSPS( xche la sintesi degli aa aromatici avviene li), NOS ter.
3) inserire un gene che detossifica il glifosato come la glifosato ossidasi (gox)
++GLUFOSINATO o FOSFOINOTRICINA:
erbicida post emergenza, ad ampio spettro, agisce solo a livello delle foglie , viene facilmente degradato. Agisce inibendo la Glutammica sintetasi GS causando accumulo di ioni ammonio e di ammoniaca che è tossica per la pianta
Strategie x Resistenza:
si usano i geni bar e pat di streptomyces che servono per detossificare la fosfoinotricina. Nel mais liberty link è stato usato il promotore 35s, il gene pat e il terminatore nos ter.

CRITICHE MOSSE A PIANTE GM RESISTENTI A ERBICIDI:
Il coltivatore usa piu erbicida perché la pianta è resistente. à no xche è vietato e perché basta un erbicida solo ad ampio spettro

INSETTICIDA: sostanza che uccide un insetto, spesso non sono molto specifici, inquinano l’ambiente e hanno costi elevati.
++TOSSINA Bt DI BACILLUS THURINGENSIS:
insetticida biologico, tossica esclusivamente per gli insetti, il batterio può essere usato fino al momento del raccolto, diversi ceppi di Thuringensis che producono tossine che sono specifiche per un tipo di insetto e non per un altro, non sono noti effetti tossici del batterio sulle piante su cui è applicato.
Il batterio produce spore in cui ci sono cristalli proteici che quando sono solubilizzati dal pH acido dell’intestino rilasciano una pro-tossina. La pro-tossina viene poi digerita dalle proteasi dell’intestino dell’insetto diventando tossina attiva ( taglio all’N terminale). La tossina si lega ai recettori delle cellule dell’intestino e crea pori che fanno passare ioni alterando l’omeostasi e facendo liasare la cellula.
I geni che codificano per le tossine Bt sono i geni cry. Ogni tossina è formata da 3 domini conservati nelle 4 classi.
Strategie di resistenza agli insetti:
create painte che contengono geni cry per l’espressione della tossina Bt. Un esempio è il mais Bt176 resistente alla piralide ottenuto per sistema biolistico e trasformato con 3 costrutti: uno per l’esperessione della tossina bt nei tessuti verdi, uno per l’espressione della tossina bt nel polline e uno per la resistenz all’erbicida fosfinotricina. Oggi non si produce piu a causa del caso della farfalla monarca.
Il mais MON810 della Monsanto resistente alla piralide ha il gene Cry1A per la tossina preceduto da una sequenza introne che ne aumenta l’espressione. E’ stato usato il promotore 35S e il terminatore Nos-ter. Non presenta resistenza a erbicidi perche il costrutto che portava la resistenza è stato perso con la selezione.
Il mais starlink solo per l’alimentazione animale è stato trasformato con il gene Cry9C
++INIBITORI DI PROTEASI:
sostanze prodotte naturalmente da alcune specie vegetali che sono tossiche per l’insetto, in particolari bloccano le proteasi dell’insetto. Non sono in commercio perché questi inibitori sono tossici anche per animali e uomo.

Impatto delle strategie:
riduzione uso di pesticidi chimici, resistenza per sempre nella pianta, colpiti solo insetti target, la proteina è biodegradabile e non inquina.

CRITICHE MOSSE A PIANTE GM RESISTENTI AGLI INSETTI
Gli insetti possono sviluppare meccanismi di resistenza perché puo cambiare il loro pH intestinale (tossine non solubilizzate), modificazione degli enzimi idrolitici(tossine non attivate), riduzione affinità per il recettore( nessun effetto tossina).
Strategia High Dose/refugeàintorno al campo in cui sono pintate le PGM pianto piante della stessa specie ma non modificate. Anche ammettendo che nella zona delle PGM si formino mutanti omozigoti resistenti all’insetticida(rr) questi si incroceranno con gli omozigoti non resistenti all’insetticida(SS) dando origine ad una prole Sr che non sarà a sua volta resistente all’insetticida.

MATURAZIONE DEL FRUTTO
Quando il seme è giunto a maturazione allora il frutto si modifica e si altera la consistenza, la colorazione, la concentrazione di zuccheri, il contenuto di composti volatili e diminuisce la concentrazione di deterrenti per i patogeni. La maturazione è controllata nei FRUTTI CLIMATERICI(=hanno un picco della respirazione associato alla maturazione) dall’ETILENE che attiva diversi geni come la POLIGALATTURONASI che degrada la pectina
FLAVR SAVE Tomato:1°alimentoOGM, rimane duro, il gene per la PG è spento grazie all’introduzione di una copia antisenso del gene tramite Agrobacterium T. Oggi non è + prodotto perché il costo era alto e era sensibile a patogeni

Strategie per bloccare la senescenza:
1. bloccare la produzione di Etilene agendo sugli enzimi della sua vai biosintetica. L’Etilene si forma a partire dalla Metionina che con SAM sintetasi viene convertitoa in SAM (S-adenosil metionina). La SAM diventa ACC Acido 1-amminociclopropancarbossilico grazie alla ACC sintasi e l’ACC diventa Etanolo grazie alla ACC ossidasi. Si bloccano i geni per l’ACC sintasi e per ACC ossidasi che sono quelli che regolano il ciclo sovraesprimendo i geni e ottenendo co-soppressione o con strategie di DNA antisenso.
2.Si inseriscono geni che codificano per enzimi che degradano i precursori dell’etilene. Ad esempio la SAM idrolisi degrada la SAM; la ACC deaminasi delamina l’ACC.
Con queste strategie la maturazione è bloccata finchè non si somministra etilene dall’esterno.

MIGLIORAMENTO QUALITA’ NUTRIZIONALI ( aa, β-carotene, lipidi, vitamine, ferrro..)
β-Carotene:GOLDEN RICE:
si fa produrre all’endosperma del riso il β-carotene grazie all’uso di costrutti che forniscono alcuni enzimi mancanti per la sintesi del β-carotene.
1) Sono stati inseriti: PSY per la Fitoene sintasi, CTR1 per la fitoene denaturasi e la carotene denaturasi, LCY per la Licopene βciclasi. Sono stati usati 2 costrutti perché erano troppi geni per un vettore solo: pZPsCàpromotore per endosperma, gene PSY, Nos-ter + promotore 35S, peptide segnale di transito del plastide, gene CTR1, Nos-ter
pZLcyHàpromotore endosperma, gene LYC, terminatore35S + promotore 35S, gene per resistenza igromicina, terminatore 35S
plasmide Ti disarmato
2) usando un solo costrutto PB19hpc ( piu plasmide Ti disarmato) è stato inserito solo il marcatore, il gene psy e il gene ctr1 fuso al peptide di transito. Si è ottenuto lo stesso β-carotene e non licopene perché si vede che nell’endosperma del riso il gene della licopene β-ciclasi è espresso.
β-Carotene:GOLDEN RICE II:
la fitoene sintasi è l’enzima limitante e nel golden rice II si è inserita una fitoene sintasi piu attiva che è quella del MAIS . Si è usato un unico costrutto: promotore gluteina, peptide segnale di transito del plastide, gene CTR1, Nos-ter + promotore glutina, fitoene sintasi di mais, Nos-ter + promotore poliubiquitina, marcatore fosfomannosio isomerasi, terminatore Nos.
E plasmide Ti disarmato. Il marcatore in questo caso non è tossico ma da vantaggi alla pianta.
Vitamina E ( tocoferolo):
composto lipofilico ad azione antiossidante e anti – radicali liberi, previene l’ossidazione degli acidi grassi e quindi incrementa la stabilità delle membrane cellulari (integrità cellulare).
Esistono diversi tipi di Tocoferoli: α β γ δ (dipendono dalla presenza di gruppi metilici sull’anello). Non tutti i Tocoferoli hanno la stessa efficacia: uguale assorbimento, diversa distribuzione nel corpo. L’α – Tocoferolo ha una maggiore capacità antiossidante rispetto agli altri e ad esso viene attribuita una % del 100% di attività antiossidante. La VITAMINA E più abbondante è il γ – Tocoferolo.Si è trovato il modo di convertire il γ - tocoferolo ad α – Tocoferolo con l’enzima γ – TMT. Facendo sovraesprimere nella pianta (di Arapidopsis) il gene della γ – TMT si ottengono livelli più alti di α – tocoferolo.
Amminoacidi
cereali hanno poca lisina, legumi poca metionina, Cio che si puo fare è Aumentare la quantità di uno specifico amminoacido, Alterare le proteine di riserva del seme, Aggiungere proteine nuove con un “corretto” contenuto di aa. Si puo aumentare la quantità di uno specifico a.a. manipolando esempio la via biosintetica che porta alla sintesi di quell’amminoacido eliminando il controllo a feedbackj negativo( mutanti di geni della via insensibili all’aa stesso).

TOLLERANZA AGLI STRESS
Molte piante sono invece suscettibili agli stress, che si distinguono di tipo biotico o abiotico
Questi segnali in alcune piante inducono naturalmente risposte adattative e la ricerca è volta a identificare nei vari tipi di piante i tratti di risposta che sono trasferibili in altre piante invece suscettibili.
Uno degli stress particolarmente studiato è quello idrico Una delle risposte piu importanti nei confronti dello stress idrico è quello dell’aggiustamento osmotico: in condizioni di stress idrico il potenziale idrico del terreno è troppo basso per cui la pianta si trova ad avere un potenziale idrico superiore a quello del terreno. In queste condizioni la pianta non assorbe più acqua dal terreno. Alcune piante (come gli spinaci) quindi abbassano il loro potenziale idrico intracellulare, mediate l’aumento della sintesi dei soluti osmocompatibili. I geni per questi enzimi sono stati clonati e usati per indurre l’adattamento osmotico in piante che normalmente non lo fanno, come arabidopsis.
Le piante che accumulano questi soluti sono tolleranti anche ad altri stress.
Un esempio è arabidopsis trasformata con la codA di globiformis e resiste a tolleranza al sale
Un'altra possibilità per indurre la tolleranza al sale è sovraesprimendo un antiporto sodio protone vacuolare, si ha accumulo nel vacuolo di sodio e l’energia arriva dalla fuoriuscita dei protoni. La sovraespressione di questo antiproto aumenta la tolleranza di arabidopsis al sale. Il sodioè accumulato nel vacuolo dove non interferisce con le attività enzimatiche e quindi può esser accumulato anche ad alte concentrazioni.
Il gene della BADH (Betaina Aldeide Deidrogenasi) viene espresso nelle piante adattate a crescere in condizioni di stress idrico – salino. Questo enzima conferisce resistenza alla Betaina Aldeide, una sostanza che aumenta il potenziale idrico della cellula perché ne diminuisce la concentrazione. L’aggiunta di Betaina Aldeide nel terreno permette di selezionare le piante trasformate, con alta efficienza rispetto alla resistenza all’antibiotico.

MODIFICAZIONE COLORE FIORE
Il colore dipende di solito dalle antiocianine che sono composti fenolici la cui colorazione dipende dagli ossidrili legati all’anello. Alcune piante non hanno alcune antocianine e sono state modificate per avere invece quel composto e il relativo colore.

BIOREATTORI: Produzione Anticorpi
Plantbodies prodotti dalle painte a basso costo, senza rischi di contaminazione con patogeni umani, mantenendo il corretto folding. Non è facile perché la molecola è complessa.
Si isola il DNA, si inserisce nel vettore, si inserisce in agrobacterium e si trasforma. Si possono mettere sequenze per indirizzare la proteina in organelli come il RE così aumenta la capacità di accumulo. Spesso gli anticorpi hanno scopo diagnostico; possono però avere anche uno scopo terapeutico. A fine anni 90 si è provato a esprimere anticorpi in pianta per farle esprimere resistenza ai patogeni. La pianta non ha sistema immunitario, eppure esprimendo anticorpi di tipo virale, come proteine del capside o replicative, la presenza di questo anticorpo ne rallenta replicazione e diffusione del virus.
Produzione proteine farmacologiche
Il vantaggio di esprimere proteine in piante è data dal fatto che la produzione in altri organismi (come batteri) non è possibile per tutte le proteine, in quanto i batteri non glicosilano, quindi non si possono produrre proteine che hanno modificazioni post traduzionali. La produzione nei semi permette ce la proteina possa esser accumulata e mantenerla per molto tempo.
C’è però uno svantaggio e riguarda la purificazione delle proteine perché è complessa.
Per aumentare la resa di queste proteine si possono esprimere proteine di fusione con un tag, per fare cromatografia di affinità, che si basa sul fatto che nella colonna nella fase fissa c’è una proteina affine al tag che trattiene la proteina e il resto viene fluito. Si usa per esempio GST che viene trattenuta da resine con glutatione.
Vaccini edibili
È costoso produrre e somministrare i vaccini, in quanto sono da conservare a temperature basse, ci vuole personale qualificato ecc I Vaccini edibili sono vaccini che possono essere mangiati e sono prodotti dalle piante.
La produzione in pianta ha vantaggi notevoli: la pianta può essere prodotta dove serve il vaccino quindi non ci sono costi di trasporto, non ci sono costi di somministrazione perché ti mangi il frutto, e poi si propaga di anno in anno. La pianta produce epitopi del patogeno, quando l’uomo mangia la pianta si mangia l’antigene e verrà indotta una risposta immunitaria.
Svantaggi: il principale è che l’antigene deve essere prodotto in una parte edibile della pianta, l’uomo non ha un vero controllo sulla produzione di questo vaccino ne sulla dose.
In oltre per quelli finora fatti si è visto che pur producendo antigeni in pianta, quando poi si facevano trials sul topo, la percentuale di copertura è molto bassa. Questo potrebbe essere dovuto alle modificazioni post traduzionali in cellule di pianta non sono identiche in quelle di uomo.

CRITICHE AGLI OGM
-per la resistenza a erbicidi
-per resistenza a insetti
-per i marcatori che danno resistenza ad un antibiotico:
Si usano per la selezione, l’obiezione principale che viene fatta è che, ingerendo il gene che codifica per la resistenza all’antibiotico, questo passi nella flora intestinale e venga trasferito a batteri patogeni. Si stanno sviluppando delle tecniche per cercare di evitare l’uso di geni marcatori o comunque di rimuovere i geni marcatori, una volta effettuata la selezione.
1) evitare completamente l’uso del gene marcatore, si fa la PCR e così si identificano le piante trasformate.
2) utilizzare geni marcatori che non abbiano attività biologiche potenzialmente dannose. Si usano marcatori Screenable Markers, sono sostanze non tossiche che aumentano l’efficienza di rigenerazione della pianta in particolari di crescita: le cellule trasformate acquisiscono un vantaggio metabolico o nello sviluppo[La Fosfomannosio isomerasi (pmi) è un enzima che permette la crescita delle piante in un terreno contenente Mannosio , La Xilosio isomerasi permette la crescita su un terreno che contiene xilosio come fonte di carbonio].
Oppure si usa il gene ipt che codifica per l’Isopentenil transferasi (ipt). I tessuti trasformati con questo gene proliferano anche in assenza di citochinine. La continua espressione del gene genera un fenotipo in queste piante denominato Extreme shooty phenotype che porta alla perdita della dominanza apicale (sviluppo dei germogli) e all’assenza di radici, cioè un fenotipo estremamente germogliante. Deve essere usato con promotori inducibili per spengerlo dopo la selezione.
3)co-trasformazione: Si inseriscono il gene marcatore e il transgene su costrutti separati che possono essere 2 vettori binari nello stesso ceppo di A. Tumefaciens o in due ceppi di Agrobacterium diversi ognuno con il proprio vettore binario
Il vantaggio è che i due costrutti diversi, uno contenente il gene d’interesse ed uno contenente il marcatore, si inserirano in 2 loci diversi del DNA e quindi poi, possono essere separati per eventi di segregazione nelle generazioni successive. Vengono così portate avanti solo le piante che possiedono il transgene e hanno perso il marcatore. La tecnica ha degli svantaggi: Uno svantaggio per le tecniche di questo tipo è che non possono essere utilizzate per piante che vengono propagate in maniera vegetativa (non utilizzano riproduzione sessuale) e anche per piante che hanno tempi di generazione molto lunghi (alberi). Un altro svantaggio è che l’efficienza è bassa: soltanto una parte delle piante che si selezionano su un terreno hanno acquisito anche il transgene per il tratto di interesse. L’efficienza è stata migliorata utilizzando dei superbinary vector: Vettori in cui è possibile inserire due costrutti, 2 T – DNA diversi, ma questi si vanno ad inserire in posizioni diverse del genoma (entrambe le cassette sullo stesso vettore binario). Questo è possibile inserendo nello stesso vettore il marcatore ed il transgene fra le regioni LB ed RB di due T – DNA diversi.
4)rimozione del gene marcatore dopo la selezione delle piante:
*1*Ricombinazione sito specifica:
nel costrutto si fiancheggia la cassetta del marcatore con le sequenze specifiche riconosciute dalla ricombinasi batterica. Il frammento così si puo excidere. Esempi: LoxP riconosciuta da ricombinasi Cre, FTR da ricombinasi Flp, RS da ricombinasi R.
Il gene della ricombinasi deve essere inserito nella pianta 1) trasformando la linee transgenica con un costrutto che la esprime, 2)sfruttando l’incrocio: incrocio tra una linea che ha il marcatore e una linea che ha la ricombinasi. Si formeranno piante che hanno sia il gene di interesse che la ricombinasi. La ricombinasi deve essere poi rimossa dalla nostra varietà in quanto puo causare problemi di riarrangiamento nel genoma e questo di fa con l’incrocio sessuale. Per questo motivo non si possono usare piante che vengono propagate solo vegetativamente.
*****Espressione transiente della ricombinasi
E’ una possibilità, si puoi iniettare in vitro l’mRNA delle ricombinasi nei protoplasti, puo avvenire se il T-DNA viene trascritto quando ancora non è stato integrato, creando la proteina di fusione Vir2::Cre tra Vir2 di Agrobacterium e la ricombinasi ( la ricombinasi arriva da Agrobacterium indipendentemente dal T-DNA).
Si puo anche fare un costrutto in cui nella cassetta del marcatore ho il gene della ricombinasi sotto un promotore inducibile. Così dopo la selezione induco la trascrizione della cassetta e ho escissione del marcatore e anche della ricombinasi senza fare incrocio e segregazione
*2*Trasposizione:
Il gene marker viene inserito su un elemento trasponibile come Ac di mais, con l’inetrvento della traspostasi il trasposone viene exciso e il marker viene eliminato. Gli sventaggi sono che l’efficienza è bassa perche il trasposone si reintegra di solito dopo l’excissione, e se il marker non è una elemento trasponibile autonomo devo inserire la traspostasi con l’incrocio e separare con segregazione
- dispersione del transgene attraverso l’ibridazione:
il flusso genico puo essere contrastato: 1) non facendo produrre polline, 2) usando un gene Terminetor che uccidono i semi prima dello sviluppo della pianta, 3) Apomissia: sviluppo dei semi senza la fecondazione (poche specie) 4) TRASFORMAZIONE CLOROPLASTI: i cloroplasti si trasmettono per eredità materna, quindi il polline ne è privo. Se inseriamo il transgene nel cloroplasto, nel polline non sarà presente. Non tutte le proteine però possono essere espresse nel cloroplasto. Il transgene non può essere trasmesso da una linea OGM ad un linea wt.
Ci sono altri vantaggi: L’inserimento del transgene nel plastoma porta ad elevati livelli di espressione del transgene non associati a silenziamento genico (molti cloroplasti e molte copie del DNA del cloroplasto). L’ambiente ossidante permette la formazione di ponti disolfuro quindi si possono far esprimere proteine (di interesse farmaceutico) composte da tali strutture.
Non si ha “l’effetto di posizione” perché l’integrazione del transgene, a livello del cloroplasto, avviene per ricombinazione omologa, quindi per l’integrazione si scelgono delle zone intergeniche ( si copia la sequenza del DNA di queste zone sul vettore) per non interferire con l’espressione dei geni del cloroplasto.
La trasformazione si effettua con Sistema biolistico o con Trattamento con PEG (polietilenglicole).
Il costrutto da utilizzare deve portare un promotore riconosciuto dalla polimerasi plastifica e puo essre organizzato come un operone perche nei cloroplasti si possono formare mRNA plicistronici. E’ importante la regione 5’UTR che aumenta la stabilità del trascrittoDopo aver effettuato la trasformazione bisogna andare a verificare che il DNA si sia inserito effettivamente a livello del cloroplasto e che non si sia inserito a livello nucleare.
La selezione va fatta tramite PCR e Southern Blotting.
Come marker va usato un marker la cui espressione nel cloroplasto permette la resistenza ad un particolare agente (aadA: AMMINOGLICOSIDE 3 –ADENILTRANSFERASI, quest’enzima conferisce resistenza a Streptomicina e Spectomicina; oppure un marcatore che da un vantaggio alla pianta come resistenza a stress salino es BADH).
Il marker si puo poi eliminare con il metodo della ricombinasi.

ANALISI OGM
% maggiore 0.9 richiede etichettatura,
-identificazione: problema è recuperare il DNA da prodotti elaborati. Si puo rilevare OGM facendo Elisa o WesterBlotting su proteine o SoutherBlotting, PCR quantitativa e qualitativa su DNA.
geni usati per determinare OGM:promotore 35S, NtpII (…….), Nos-ter, bar e pat (resistenza fosfoinotricina)
PCR qualitativaà i primer si disegnano sulla base delle sequenze dei geni piu usati negli ogm, alcuni primer danno specificità piu alta, alcuni piu bassa, e cio serve per identificare uno specifico OGM. Il primer per 35S è aspecifico e sta nell’85% delle specie OGM quindi non permette di identificare di quale OGM si tratta. Per fare cio si usano primer complementari alla zona di giunzione tra primer e geneX.
2 metodi :1)Quantitative end – point PCR, 2) Real – Time PCR: x la quantità di DNA presente nel campione e valutare la quantità di transgene

Fonte: http://sommofabio.altervista.org/BiotecnologieVegetali/Marzia-BiotecVegetali.doc

Biotecnologie vegetali